陆地棉GhbHLH130和GhZFP130基因克隆及功能分析
作者单位：南京农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：唐灿明
授予年度：2014年
学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种]
摘 要：高盐、干旱、低温等非生物胁迫严重阻碍作物生长发育,影响品质、产量的形成。在长期的进化过程中,植物形成了一整套耐逆性机制以适应、抵御外来逆境的伤害。研究植物适应胁迫过程中的重要基因的功能,了解其耐逆性分子机制,利用该基因进行基因工程改良,对于提高植物自身耐逆性有重要意义。迄今为止,在植物中已经分离和鉴定的耐逆性基因多达数百个,包括功能基因和调控基因两大类型。其中,碱性/螺旋-环-螺旋(basic/Helix-Loop-Helix, bHLH)家族转录因子和锌指蛋白家族广泛参与植物的胁迫应答反应过程。bHLH家族转录因子,具有螺旋-环-螺旋基序而得名,主要通过与DNA、RNA的结合或与其他蛋白质的相互作用调控目的基因的表达。研究发现该家族转录因子广泛参与植物耐非生物胁迫途径,但在棉花中的研究甚少。锌指蛋白,因其蛋白结构中含有指状结构域而得名,锌指蛋白广泛分布于植物和动物中,根据锌指蛋白结构和功能差异,将锌指蛋白分为Zim17家族、TFⅢA家族、WRKY家族、PHD家族、GATA家族等。本文主要针对棉花受非生物逆境胁迫过程中芯片数据显示bHLH家族基因和锌指蛋白家族基因表达量发生上调为基础,分离了bHLH家族基因GhbHLH130和锌指蛋白家族基因GhZFP130基因,取得如下结果。1.首次从陆地棉中分离了GhbHLH130基因和GhZFP130基因。同源序列比较表明,GhbHLH130基因编码了一个bHLH家族转录因子,氨基酸序列表明GhbHLH130有一个HLH结构域,属于bHLH转录因子,聚类分析表明该基因与可可、大豆、水稻中bHLH转录因子亲缘关系较近。GhZFP130编码了一个Zim17型锌指蛋白,该锌指蛋白家族基因研究较少。氨基酸序列表明GhZFP130有一个zf-DNL结构域,属于Zim17型锌指蛋白。多序列比对,发现该蛋白与可可、水稻、酵母等Zim17型锌指蛋白有保守结构域,在其他物种中,该蛋白协助线粒体蛋白运输进入线粒体基质,但是很少有学者研究该类型锌指蛋白的抗非生物胁迫能力。跨膜结构分析表明在其64-82个氨基酸和142-160个氨基酸之间存在两个跨膜结构域(TM),因此推测GhZFP130可能作为一种重要调控因子起作用。GhZFP130是棉花中首次被克隆的Zim17型锌指蛋白基因,对其表达及功能探索将大大促进整个Zim17型锌指蛋白家族的研究。2.将GhZFP130-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内瞬时表达,在洋葱表皮细胞的线粒体内观察到绿色荧光。GhbHLH30-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内瞬时表达,激光共聚焦显微镜下观察到该蛋白在洋葱表皮细胞核内表达。3.荧光定量分析GhbHLH130基因和GhZFP13O基因在高盐、干旱、低温和ABA诱导下的表达模式。GhbHLH1130基因的表达受外源ABA、高盐、干旱、低温的诱导,且响应外源ABA较早,表明GhbHLH1130基因对高盐、干旱、低温的响应可能参与了依赖于ABA的信号转导途径。GhZFP130基因显著受干旱、外源ABA的诱导表达,但是响应低温和NaCl诱导时间较晚。PEG6000和外源ABA处理棉花根部,GhZFP130基因显著上调;GhZFP130基因响应NaCl胁迫较晚,NaCl处理6h后,GhZFP130基因上调表达;低温处理,GhZFP130基因几乎不表达;表明GhZFP130基因受PEG6000、外源ABA的显著诱导,GhZFP130基因可能参与依赖于ABA信号通路的抗旱途径。4.构建PBI121-GhbHLH130过表达载体转化烟草,获得T0代转基因烟草植株8株。比较T0代转基因烟草植株和野生型烟草植株在自然干旱条件下的生长情况,发现转基因烟草相对于野生型叶片更加坚挺,而野生型烟草叶片出现卷边。构建PBI121-GhZFP130过表达载体转化拟南芥,获得T0代转基因拟南芥植株6株。对野生型和转GhZFP130拟南芥T0代植株在自然条件下进行离体叶片失水率试验,发现野生型和转GhZFP130离体拟南芥叶片迅速失水,但转GhZFP130拟南芥失水率低于野生型。结果表明转基因植株比野生型具更高的耐旱性。上述试验表明GhbHLH1130基因和GhZFP130基因可能参与棉花抗非生物胁迫途径的调控,为棉花的抗逆遗传育种工作奠定了基础。
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