蚧虫基因组DNA提取及微卫星引物多态性扩增研究

作     者：石晶 

作者单位：山西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谢映平

授予年度：2005年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：蚧虫 基因组DNA 微卫星引物 多态性扩增 分子遗传标记 

摘      要：本试验对日本龟蜡蚧(Ceroplastes japonicus Green)、角蜡蚧(Ceroplastes ceriferus Fabricus)、白蜡绵粉蚧(Phenacoccus fraxinus Tang)、瘤大球坚蚧(Eulecanium gigantea Shinji)和朝鲜球蚧(Didesmococcus koreanus Borchsenius)等5种蚧虫基因组DNA的提取和微卫星引物多态性扩增进行了研究,试图寻找一种能有效用于蚧虫分类和系统学研究的分子遗传标记。研究结果如下: (1) 确定了一种能较稳定和大规模在实验室条件下提取蚧虫不同种类基因组DNA的方法。并且经过OD值的测定、酶切的检测和扩增实验,证明了该方法得到的DNA样品完全可以满足微卫星引物扩增的要求。通过对比若虫、雌成虫、雄成虫和卵不同虫态和酒精浸泡、阴干、烘干和冷冻不同保藏方法处理的标本的提取结果,表明该方法可以用于蚧虫的若虫、雌成虫和卵的基因组DNA提取,并且对用酒精浸泡、烘干和冷冻保存的标本也有较好的提取效果。但对雄成虫和阴干保藏的标本不适用。 (2) 建立了微卫星扩增的最适扩增体系。 在保持反应体系和实验条件一致的情况下,本研究建立的蚧虫基因组DNA的单位点微卫星引物扩增体系的重复性和稳定性良好。 通过温度梯度试验,确定出各微卫星引物的最适合退火温度分别为:33.15微卫星核心序列,54℃;(CAC),57℃。但(GATA)在所设温度梯度下未能获得扩增产物,说明该序列与基因组DNA蚧虫无匹配序列。 优化的PCR扩增体系:模板DNA(蚧虫基因组DNA)4μL,微卫星引物15ng,dNTP 5mmol/L,Taq酶2U,10×buffer(不含Mg+))2.5μL,Mg2.5mmol/L,用双蒸水将反应体系体积加至25μL。 (3) 微卫星引物33.15核心序列在5个种的扩增中出现的条带数目都比较多,能反应遗传多态性特点,它是一条遗传多态性研究较好的通用性引物。微卫星引物(CAC)序列的种的特异性较强,在日本龟蜡蚧和白蜡绵粉蚧的扩增中条带偏少。