玉米转录因子ZmEREB192、ZmEREB25参与胚乳淀粉合成的研究
作者单位：四川农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：黄玉碧
授予年度：2017年
主 题：玉米淀粉 转录调控 转录因子ZmEREB192 转录因子ZmEREB25 突变体
摘 要：淀粉是由单分子葡萄糖聚合而成的高分子化合物,被大量量应用于食品、工业等领域。玉米（***）作为世界第一大粮食作物,其籽粒中约有70%的储藏物质是淀粉。玉米淀粉是化学成分最佳的淀粉之一,其生物合成路径是一个涉及众多酶的系统网络,其中有五类非常关键的酶,分别是:腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylases,AGPases）、淀粉合成酶（starch synthases,SSs）、淀粉分支酶（starch branching enzymes,SBEs）、淀粉去分支酶（starch-debranching enzymes,DBE）以及淀粉磷酸化酶（starchphosphorylases,PHOs）。各类关键酶分别由不同基因编码。目前,生物学领域对关键酶酶学性质的探索已经比较彻底,但针对关键基因表达调控机理的研究却相对有限。转录调控是淀粉生物合成众多调控途径中非常重要的一种方式,且往往同信号分子偶联相关。已有少量研究报道转录因子能够通过调节淀粉生物合成过程中多个关键基因的表达影响籽粒淀粉含量和作物种子产量。本研究以玉米骨干自交系18-599为实验材料。前期通过共相关分析筛选得到一组候选转录因子,结合蔗糖、激素处理玉米胚乳的转录组测序结果,将AP2/EREBP家族转录因子ZmEREB192和ZmEREB25确认为候选转录因子,对其参与玉米淀粉生物合成的调控机制进行初步解析。通过RT-PCR及实时荧光定量PCR对候选基因的表达模式进行分析;通过亚细胞定位和酵母激活实验验证候选转录因子的结构特性;通过基因枪介导胚乳的瞬时过表达和酵母单杂交验证候选转录因子调控淀粉合成关键基因的表达情况;通过对候选转录因子ZmEREB192 Mu插入突变体材料的鉴定,从遗传表型上分析ZmEREB192对胚乳淀粉合成的调控;以ZmEREB25为诱饵基因构建载体进行酵母双杂交筛选文库,验证其是否与其它蛋白相互结合。具体研究结果如下:1.成功从玉米胚乳中克隆得到候选基因ZmEREB192和ZmEREB25。ZmEREB192的基因编码区为990bp,编码的蛋白质包含329个氨基酸;ZmEREB25的基因编码区为879bp,编码的蛋白质包含292个氨基酸。分析候选基因氨基酸序列,发现两者均含有一个AP2保守结构域,是隶属于AP2/EREBP家族下不同亚家族的转录因子。2.采用半定量RT-PCR及实时荧光定量PCR对候选转录因子的表达模式进行分析。结果表明候选基因ZmEREB192和ZmEREB25分别在多个组织中表达,且在胚乳发育不同时期都有较高表达,于授粉后12d-15d表达量达到最高,该时期是玉米胚乳淀粉合成的关键期。采用实时荧光定量PCR检测候选基因在蔗糖、ABA、蔗糖与ABA共同处理条件下的表达情况。结果表明蔗糖显著上调ZmEREB192的表达,极显著上调ZmEREB25的表达;ABA显著抑制ZmEREB192的表达,却显著上调ZmEREB25的表达;蔗糖和ABA共同处理极显著上调两个候选基因的表达。该结论与前期转录组测序结果一致。3.利用基因枪轰击洋葱表皮进行亚细胞定位,发现候选转录因子ZmEREB192、ZmEREB25均定位于洋葱表皮细胞的细胞核中。通过酵母激活实验验证候选基因编码蛋白的转录活性,结果表明候选转录因子ZmEREB192具有转录激活活性,而ZmEREB25没有转录激活活性。因此以转录因子ZmEREB25为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛库,筛选得到一个响应生长素的转录因子ARF27。但两个蛋白是否互作需进一步验证。构建候选基因启动子连接报告基因Gus的载体,通过基因枪轰击介导入授粉后15d的玉米胚乳,GUS染色后观察胚乳显色情况,发现两个候选基因在胚乳的淀粉合成区域均有表达。4.利用基因枪介导玉米胚乳的瞬时过表达及酵母单杂交实验发现:转录因子ZmEREB192通过与启动子pSu2、pSS1、pSh2直接结合抑制其活性,而间接作用于pAe、pDu1、pBt1使其活性显著降低;转录因子ZmEREB25对启动子pSh2、pSS1、pBt1活性的促进作用是间接的,而对pDu1、pBt2活性的增强则是通过与其直接结合引起的。5.根据基因登录号,登录MaizeGDB网站进行序列比对,从Mu突变体库中找到转录因子ZmEREB192的突变体材料。对其回交2代,自交1代后的T3代材料进行鉴定,得到6株纯合体植株,15株杂合体植株。对突变体材料及对照野生型W22中的总淀粉含量、直链淀粉含量、支链淀粉含量分别进行测定,结果显示突变体材料中总淀粉含量比野生型材料中总淀粉含量高10.4233mg/g（质量比）,且主要由支链淀粉含量增加引起。
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