A型肉毒毒素抗原表位及抗体研究
作者单位:中国人民解放军军事医学科学院
学位级别:硕士
导师姓名:张惟材;熊向华
授予年度:2016年
学科分类:1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学]
摘 要:肉毒神经毒素(botulinum neurotoxins,BoNT)是一类烈性的蛋白类神经毒素,由厌氧的肉毒梭菌产生,是目前已知毒性最强的毒素。近年来,肉毒毒素在民间不时引发群体中毒事件,在军事上也可能作为恐怖剂和生物战剂被谬用,因此肉毒毒素的研究受到了各国研究者的关注。BoNT由一条相对分子质量为100kDa的重链和一条相对分子质量为50kDa的轻链通过二硫键连接而成。轻链(BoNT/AL)是毒素的毒性成分,具有Zn2+依赖性的内肽酶活性。重链(BoNT/AH)包含两个区域,N端(BoNT/AHn)主要通过在细胞膜上形成离子通道在内化过程中起作用,重链C端(BoNT/AHc)是受体结合区域,也是主要中和抗原的决定区,具有完全保护效应,位于BoNT/AHc的抗原表位为中和抗体的筛选提供依据。已知的BoNT/A受体包括神经节苷脂(ganglioside,GT1b)、突触囊泡蛋白2(Synaptic Vesicle protein 2,SV2)及2013年新发现的成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor 3,FGFR3),其中GT1b和SV2与BoNT/A的结合位点已被阐明,新受体FGFR3与BoNT/A的结合位点还未被阐明。一般认为中和抗体的解毒机制是通过与BoNT/AHc结合从而封闭毒素与受体的结合起到解毒作用,因此受体的结合位点与中和抗体的结合位点在空间结构上存在一定的关联性,明确新受体FGFR3与BoNT/AHc的结合位点以及三个受体的相互作用关系可为肉毒毒素中和抗体研究提供有用信息。目前治疗肉毒中毒没有有效的化学药物,主要采用马源性血清进行治疗,但马血清存在病毒污染风险、过敏反应等弊端。近几年,随着基因工程生产人源化工程抗体的发展,发现单个抗体使用效果不好,几个单抗联用可以起到很好的中和保护效果。加利福尼亚大学、本所孙志伟教授课题组以及美国的XOMA公司分别筛选到了针对BoNT/A不同抗原表位的单抗组合。本研究的筛选工作是将抗原表位分析和抗体筛选结合起来,由表位分析指导抗体筛选,通过构建突变体库和抗体库对抗体进行筛选,明确单抗对应的抗原表位及受体结合表位,为抗体药物的开发及抗体解毒机制奠定基础。根据BoNT/AHc晶体结构利用Discovery Studio软件进行分析,并参照其二级结构和空间位置,预测了毒素150个可能参与到抗原表位的氨基酸序列,设计突变引物将这些氨基酸每3-5个为一组进行突变,利用快速定点突变技术构建了30个BoNT/AH多联氨基酸突变体,并以BoNT/AH突变体为模板,利用分子克隆技术构建了22个BoNT/AHc多联氨基酸突变体。BoNT/AHc突变体用SDS-PAGE分析均为可溶性表达,经Ni-chelating sepharose螯合介质纯化蛋白纯度均在85%以上。构建了bont/ahc表达载体,大规模发酵制备并纯化了bont/ahc,以此为抗原免疫小鼠筛选单抗阳性细胞株,拟获得50个以上单抗,目前已获得1a4、3h3、3h7、5h8等4个单抗。经鉴定细胞上清效价均高于3.0×103,均能与bont/ahc特异性结合,且4株单抗抗原识别表位相近,单抗亚型鉴定结果为1a4、3h7属于igg1(Κ),3h3属于igm(Κ),5h8属于igg2b(Κ)。另制备了文献报道的3个位点明确的单抗c25、s25和3d12,其中单抗3d12是在原来序列基础上进行几个位点突变制备的抗体,经鉴定3d12抗体效价为1.22×106,能与bont/ahc特异性结合,亲和力常数k=10.6×108l/mol。此外还对本实验室筛选到的3个人源单抗ml01、ml02和ml03进行了制备和分析,单抗ml01针对bont/ahc效价为5.12×105,单抗ml02针对bont/ahc效价为1.28×105,ml01亲和力常数kd=2.80×10-9mol/l,ml02的亲和力常数kd=6.89×10-9mol/l。两个单抗均能与bont/ahc特异性结合,动物实验表明,单抗ml01对bont/a的中和效价为16ld50/μg,单抗ml02对bont/a的中和效价为4ld50/μg,两个单抗的中和保护效果很好,具有进一步开发的前景。通过elisa的方法考察了突变体与受体和单抗的相互作用情况,分析突变体与受体、单抗结合能力的变化来确定受体、单抗与bont/ahc的结合表位,进而通过组合和中和实验筛选有效抗体组合。在检测突变体蛋白与受体fgfr3的结合情况前,首先通过检测bont/ahc突变体与已明确位点的受体sv2c的结合情况对elisa的方法进行了验证,实验结果表明与受体sv2c结合力下降的突变体突变位点覆盖了受体sv2c已明确的位点,说明了用elisa的方法检测突变体蛋白与受体的