性腺激素对初情期大鼠生殖轴上NKB、GnRH和Kisspeptin表达的影响

作     者：崔培 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李福宝;方富贵

授予年度：2014年

学科分类：08[工学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 0836[工学-生物工程] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

主      题：神经激肽B 雌性大鼠 性腺激素 初情期 Kisspeptin 

摘      要：初情期启动的早与迟直接影响动物的性成熟和以后的繁殖性能,但其机制仍不清楚。研究表明,在动物初情期发育的调控中,下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin releasinghormone, GnRH)神经元所分泌的GnRH是初情期启动的决定性因素。一般认为,动物在初情期之前,下丘脑GnRH神经元对性腺类固醇激素的负反馈作用十分敏感,因而在出生后到初情期前这段时间,下丘脑GnRH的分泌因受性腺类固醇激素的作用而一直处于抑制状态,呈现低幅度、低频率的分泌脉冲;初情期的启动始于下丘脑性腺激素抑制机制的解除,但GnRH神经元上并没有性腺激素受体,那么,在性腺激素调节GnRH分泌机制中,应该有对性腺激素敏感的其他中间神经元介导性腺激素对GnRH的调节作用。近期研究发现,神经激肽B (neurokininB,NKB)和Kisspeptin神经元上均有性腺激素受体的表达,二者均能促进GnRH释放和初情期启动。因此,探究动物初情期启动中NKB、Kisspeptin、GnRH和性腺激素受体间的关系尤为重要。目前国内外关于NKB、Kisspeptin和GnRH的研究,多集中于NKB、Kisspeptin和GnRH在不同物种中枢神经系统上的定位和其与初情期的关系的研究,缺少对其在生殖轴上整体的定位研究以及对Kisspeptin、NKB 和 GnRH与性腺激素水平关系的研究。本试验以皮下埋植性腺激素、卵巢摘除等处理方法,以雌性SD大鼠为研究对象,采用免疫荧光三标技术来观察各个组大鼠生殖轴上NKB、Kisspeptin 和 GnRH的分布情况,运用nage J 和 Image-pro plus 6.0软件分别计数和测量各组大鼠生殖轴上NKB、Kisspeptin和GnRH的阳性细胞数和平均荧光强度,并分析其间的关系及变化规律。同时结合实时荧光定量PCR、酶联免疫和放射性免疫等分析方法,来阐述NKB、Kisspeptin和GnRH在机体性腺激素水平改变时的变化及其三者间潜在的联系,为进一步研究NKB、Kisspeptin和GnRH在雌性大鼠生殖功能上的作用及其机制提供科学的理论依据。结果显示：(1) E2 (29±0.71d)、E2+P4 (28±1.53d)、OVX+E2 (30±0.38d) OVX+E2+NKB (28±1.18d) 和 OVX+E2+P4+NKB (28±0.52d)组大鼠均比Oil(43±1.38d)组大鼠阴门开启的时间显著提前(P0.05)。(2)NKB主要分布于大鼠下丘脑的弓状核、室旁核和腹内侧核,腺垂体以及卵巢的黄体细胞、卵泡膜、颗粒细胞和间质细胞上,且不同部位表达的荧光强度存在差异(P0.05)。①大鼠弓状核上的免疫荧光强度显著高于室旁核和腹内侧核(P0.05)②卵巢摘除组的大鼠弓状核上NKB阳性神经元数显著高于E2和E2+P4组(P0.05),大鼠室周核上的NKB阳性细胞数目较少(P0.05),且仅在OVX+E2+P4+NKB、OVX+E2+P4 和 E2+P4组中分布。③Oil组大鼠下丘脑和腺垂体上的NKB荧光信号显著强于E2、E2+P4、OVX+E2和OVX+E2+P4组(P0.05)。④大鼠卵巢黄体细胞、卵泡膜和颗粒细胞上的平均荧光强度显著高于间质细胞(P0.05)。(3)GnRH主要分布于大鼠下丘脑的正中隆起、弓状核和视前区,且以正中隆起处的荧光信号最强(P0.05)。①E2和E2+P4组大鼠,其下丘脑GnRH的阳性细胞数高于卵巢摘除大鼠(P0.05)。②大鼠正中隆起处GnRH的平均荧光强度显著高于弓状核和视前区(P0.05),且同一核团上,E2和E2+P4组大鼠GnRH的平均荧光强度值也较高(P0.05)。(4)Kisspeptin主要分布于大鼠下丘脑弓状核、室旁核、视前区和室周核。①Kisspeptin的阳性细胞数目以弓状核最高,室旁核和视前区次之,室周核较少(P0.05)。埋植性腺激素的大鼠室周核上Kisspeptin的阳性细胞数目增多(P0.05)。(5) OVX+E2、OVX+E2+P4、OVX+Oil、OVX+E2+NKB、OVX+E2+P4+NKB和 OVX+Oil+NKB组大鼠下丘脑Tac-2、GnRH、 Kiss-1的基因表达量显著高于E2、E2+P4和Oil组(P0.05)。OVX+E2+NKB、OVX+E2+P4+NKB和OVX+Oil+NKB组大鼠下丘脑ERa的基因表达量显著高于E2、E2+P4和Oil。且ERa与Tac-2和GnRH基因表达呈正相关,而Kiss-1与ERa基因呈负相关。(6)Oil组大鼠血清中NKB的含量显著高于OVX+E2和 OVX+Oil组(P0.05)。OVX+E2+P4+NKB、OVX+