草鱼与3种脊椎动物MHCⅠα基因的克隆及其多态性比较

作     者：戴薇 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：余为一;陈芳芳

授予年度：2014年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

主      题：草鱼 MHC Iα基因 α1和α2区域 多态性 

摘      要：主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)是存在于脊椎动物特定染色体上、呈高度多态性的一组基因群。其中,MHC Ⅰ类分子由α链和β2m微球蛋白组成。α链呈现高度多态性,包括胞外段结构域(α1、α2和α3)、跨膜区(TM)和胞浆区(CY)。α1与α2区域构成的肽结合区(PBR)能与抗原多肽结合,由此诱导机体产生特异性免疫应答。MHC Ⅰ类分子的多态性引起结构和功能的多样性,从而导致机体对特定病原体抵抗力的差异。因此,研究MHC Ⅰ分子α的多态性特征有助于揭示分子进化规律和免疫防御机制。本文主要阐述低等脊椎动物草鱼(Ctenophaiyngodon idellus, Ctid) MHC Ⅰ α基因结构特征和多态性规律,并与脊椎动物中的小鼠、牛和鸡进行分析比较。首先,抽提草鱼三个个体的血液总RNA,经RT-PCR方法扩增Ctid-MHC Ⅰ α基因,连接pMD18-T载体后转化*** DH5a感受态细胞,每个个体挑选20个阳性克隆送公司测序。其次,使用生物信息学软件分析Ctid-MHC Ⅰ α基因结构和多态性特征,并与脊椎动物中小鼠、牛和鸡MHC Ⅰ α基因多态性进行比较。结果显示,克隆到大小约为1027bp的Ctid-MHC Ⅰ α基因片段,测序获得了54条cDNA序列。草鱼单个个体存在1-3种MHC Ⅰ α基因型,共筛选出5条Ctid-MHC Ⅰ α基因型序列,上传至GeneBank数据库,获得了相应的基因序列登录号(KF831073-KF831077),同时,获得了小鼠(KF831063-KF831067)、牛(KF831068-KF831072)和鸡(KF274027-KF274031)各5条MHCⅠ α基因序列登录号。序列分析表明,Ctid-MHCIα基因共编码332个氨基酸(aa),分别对应21个aa的信号肽,88个aa的α1区域,90个aa的α2区域,91个aa的α3区域和42个aa的TM/CY区域。Ctid-MHC Ⅰ α分子存在丰富的遗传多样性,所编码的5个区域中共存在150个氨基酸变异位点,其中有102个变异位点分布在α1l和α2区域。多态性分析显示,PBR区域共有16个氨基酸多态性位点(Wu-Kabat得分≥4),9个分布在α1区域,7个分布在α2区域,其中有4个峰值较高的多态性位点(Wu-Kabat分值≥8)分别位于第55、77、80和125位氨基酸残基。11个多态性氨基酸位点位于PBR空间结构的α螺旋或β折叠上,处于抗原递呈的关键部位。此外,Ctid-MHC Ⅰ α基因错义替换率(dN)和同义替换率(dS)的比值(R)小于1,推测其分子演化方式受自然环境的负向选择作用,而其他脊椎动物均为正向。进化树分析表明,Ctid-MHC Ⅰ α分子与其他脊椎动物亲缘关系较远,单独构成一大分支,且个体间继续分化为不同的亚支,个体差异不明显。综上所述,草鱼与小鼠、牛、鸡MHCⅠ α分子均具有高度多态性特征,α1和α2区域是多态性的主要富集区。四个物种PBR的空间结构相似,多态性氨基酸残基主要分布在抗原递呈的关键部位a螺旋或p折叠上。但Ctid-MHC Ⅰ α分子与其他脊椎动物亲缘关系较远且进化方式不同。本实验从遗传学角度系统的阐述了Ctid-MHC Ⅰ α基因多态性特征和分子进化规律,为深入探究低等脊椎动物MHC分子的生物学特征奠定基础。