OPCML蛋白在杆状病毒—昆虫系统中的表达及其活性研究

作     者：覃宇翔 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姚德生

授予年度：2011年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：OPCML基因 克隆 表达 杆状病毒表达系统 SF9昆虫细胞 

摘      要：[研究背景和目的] OPCML是定位于染色体11q25的基因,包含有7个外显子,跨越600kb,分子量约为60kd,表达的蛋白位于细胞膜,属于鸦片受体类的细胞粘附因子[1],广泛存在于神经系统细胞中,在调节鸦片受体和信号传导上具有重要的作用,促进细胞分化以及改变细胞膜性质。之前绝大多数的研究主要集中在中央神经系统细胞中细胞之间的粘附、识别及信号传导上,通过激活腺苷酸环化酶(AC)和相关离子通道而发挥作用[1]。已有的研究证实人染色体11q25的LOH(loss-of-heterozygosity)与卵巢上皮癌的不良预后呈正相关,因此推测在这个区域里存在与卵巢上皮癌相关的抑癌基因(TSG),OPCML则是这些候选的TSG之一。本研究利用连接目的基因OPCML的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞,鉴定OPCML基因在SF9昆虫细胞中的表达,对其表达条件进行初步探索及最佳的蛋白纯化方法,并验证其对卵巢癌细胞系A2780的增殖、粘附能力及细胞周期的抑制作用。 [材料和方法] 试验一:OPCML基因全长扩增和携带其基因的昆虫表达载体的构建 参考GenBank上发表的OPCML基因序列设计引物,从CD1小白鼠脑组织中克隆OPCML基因片段,将OPCML基因连接到PACGp67A质粒上,获得OPCML-PACGp67A质粒,利用PCR、酶切技术检测质粒连接成功。 试验二: OPCML蛋白在SF9昆虫细胞中的表达 选择生长状态良好的SF9昆虫细胞,用重组杆状病毒OPCML-PACGp67A感染,观察感染症状;利用SDS-PAGE分析蛋白条带分子量大小;以不同剂量的病毒感染液感染SF9细胞,感染的持续时间不同,选择表达量高的感染时间作为最佳表达时间;利用Western blot技术检测OPCML基因在昆虫细胞中的表达。 试验三:OPCML与卵巢癌细胞增值、粘附、生长周期的体外实验 将从昆虫细胞中大量表达、纯化的OPCML蛋白直接作用于体外培养的卵巢上皮癌细胞A2780,检测作用前后增殖指数、生长曲线、细胞周期等生物学行为的变化。 [结果] OPCML基因连接到杆状病毒载体PACGp67A质粒上,获得OPCML-PACGp67A质粒,利用PCR、酶切技术检测质粒连接成功。重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞感染时间在5-6天表达量最高,成功表达OPCML蛋白并进行OPCML蛋白纯化。为进一步研究和应用OPCML蛋白打下了基础。流式细胞数测定细胞周期结果显示,OPCML蛋白并不影响A2780细胞的生长周期,细胞增殖实验也显示OPCML蛋白对卵巢癌细胞增殖无明显抑制作用。但细胞粘附实验结果显示,OPCML蛋白可以提高A2780细胞的粘附力,但需有足够的蛋白浓度。 [结论] 1.克隆OPCML基因开放阅读框序列,并成功构建真核表达重组质粒OPCML-PACGp67A。 2.感染重组病毒的昆虫SF9细胞大量高效表达OPCML蛋白,经过纯化后,Western-blot验证所表达的蛋白与理论OPCML蛋白吻合。 ***蛋白对A2780细胞的增殖无抑制作用,但能增加细胞间的粘附。 ***作为一个抑癌基因,对卵巢的靶向治疗可能存在很大的潜力。