类人胶原蛋白Ⅱ/纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合骨修复材料制备关键技术的研究

作     者：高琛 

作者单位：西北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：米钰

授予年度：2009年

学科分类：08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 

主      题：重组类人胶原蛋白II 纳米羟基磷灰石 壳聚糖 骨髓间充质干细胞 骨修复材料 

摘      要：目的:依据结构仿生和过程仿生的思路,采用静电自组装技术制备重组类人胶原蛋白Ⅱ(RHLCⅡ)/纳米羟基磷灰石(nHA)/壳聚糖(CS)复合骨修复材料,解决动物源胶原基骨修复材料存在的病毒隐患等安全问题以及纳米羟基磷灰石陶瓷材料无成骨诱导活性的问题。提高材料的生物相容性、赋予材料成骨活性,探讨材料的优化机制,研究兔源骨髓间充质干细胞种植于材料的诱导成骨情况。为研究新型骨修复和细胞载体材料提供实验数据,获得具有广阔市场前景的骨修复替代材料。 方法:1.纳米羟基磷灰石的制备:依据仿生的思路,实验采用贝壳和无机金属盐,以水热合成法和沉淀法制备羟基磷灰石,通过XRD、SEM以及ZETASIZER粒径测试仪对其结构、晶相、粒径进行分析比较,首先筛选出纳米低结晶羟基磷灰石的制备方法。 2.类人胶原蛋白Ⅱ(RHLCⅡ)/纳米羟基磷灰石(nHA)/壳聚糖(CS)复合骨修复材料的制备:为使材料无机界面与有机界面牢固结合,抗压强度达到骨修复材料标准,本实验采用共混法和原位滴定法制备类人胶原蛋白Ⅱ(RHLCⅡ)/纳米羟基磷灰石(nHA)/壳聚糖(CS)复合骨修复材料。通过机械强度和均匀性的比较,最终筛选出适合材料组分复合的方法。并首次选择天然交联剂京尼平交联复合材料,在增强组分间结合能力的同时避免了使用化学合成交联剂戊二醛等对细胞产生毒性危害的缺陷,制备了新一代RHLCⅡ)/nHA/CS复合骨修复材料。 3.建立模型对制备工艺进行优化:本实验依据单因素实验结果,借助MINITAB统计学软件,采用Plackett-Burman设计和响应面优化法对复合材料成型工艺进行了优化。通过X射线衍射(XRD)、红外光谱(FTIR)、扫描电镜(SEM)、MTT比色法等对材料的微观结构、力学性能和生物相容性进行了表征,同时通过Unico UV对交联反应做了跟踪测定,初步了解了天然化合物京尼平对骨复合材料的交联程度,最终获得制备复合材料的优选方案。 4.成骨诱导性能评价:本实验将骨髓间充质干细胞(BMSCs)种植于骨修复材料上,对BMSCs在复合材料上的成活率、贴附率、ALP活性以及钙结节现象进行了观察分析,评价材料与BMSCs复合的诱导成骨性能。 结果:1.新一代RHLCⅡ/nHA/CS复合骨修复材料的优选制备方案为:(1)原位滴定法按组分配比为nHA/RHLCⅡ=1.53在弱碱性环境下反应制备nHA/RHLCⅡ粉末;(2)加入壳聚糖浓度为2%±1%的粘稠溶液,充分混匀后加入京尼平,使京尼平终浓度达0.61%,倾入不锈钢模具,在4℃下冷藏24h;(3)置于-80℃超低温冰箱预冷冻3 h后真空冷冻干燥48 h。PBS(pH=7.3)缓冲液反复浸洗,二次冻干后置于干燥器中保存。(4)移植前,支架材料经灭菌后与BMSCs细胞在体外共培养,材料具有成骨活性后可直接移入受损部位。 2.制备的骨修复复合材料具有以下特征:无机相为平均大小为30nm的弱结晶纳米羟基磷灰石;材料为三维多孔材料,孔径在75～100μm之间,孔隙率在90%以上;无机相与有机相比为26:74,且相面结合紧密,机械强度可达80.46MPa;细胞毒性评为1级,在诱导培养基条件下,BMSCs细胞能够紧密贴附在材料表面及内部,经14天共培养后无死细胞出现,贴附率接近100%,ALP值是对照空白样的10倍,且7天后就有钙结节产生。 结论:本文首次对RHLCⅡ/nHA/CS骨修复材料的制备关键技术进行了系统研究,通过优化机制制备的RHLCⅡ/nHA/CS多孔支架材料从组成和结构上与自然骨相似,抗压强度可达80.46MPa,与BMSCs细胞复合后表现出良好的成骨活性,是一种功能、结构与自然骨相似且安全性能高的优选骨修复材料。通过控制材料组分的配比可获得不同机械强度需求的骨修复材料,因此有望应用于商品化生产,满足社会对不同机械强度骨修复材料的要求,解决社会骨修复材料供应量不足的问题。