新疆细毛羊INHα亚基基因的克隆、序列分析与表达

作     者：张成云 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾宪垠

授予年度：2008年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：新疆细毛羊 抑制素α亚基 序列分析 原核表达 

摘      要：抑制素(inhibin,INH)是一种主要由性腺产生的,由α和β亚基通过二硫键构成的异二聚体糖蛋白质激素,是转化生长因子β(transforming growth factorsβ,TGF-β)超家族成员。在体内,INH主要抑制促卵泡激素(follicle-stimulatinghormone,FSH)的合成和分泌。本研究研究了新疆细毛羊INHα亚基基因的克隆及其成熟区在表达菌株BL21(DE3)中的融合表达,以期为今后开展INH免疫对动物繁殖率影响的研究提供资料。 根据GenBank上登录的新西兰绵羊抑制素α亚基基因序列(L28815),设计合成了2对引物,以新疆细毛羊卵巢提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增获得了约800bp片段,克隆到pMD18-T载体,经测序和序列分析证实为新疆细毛羊抑制素α亚基基因。测序结果表明扩增出一条长812bp的DNA片段,编码265个氨基酸残基的INHα亚基前体。新疆细毛羊与新西兰绵羊INHα亚基cDNA的同源性为98.6%,氨基酸的同源性为98.1%;成熟区核苷酸序列仅有1个碱基的差异,为同义变异。生物信息学分析表明:该序列与牛INHαcDNA的亲缘关系最近,为96.0%;其次与猪、马和人INHα的cDNA亲缘关系较近,分别有88.1%、87.8%和85.8%;而与小鼠和大鼠INHα的cDNA同源性较远,分别为84.2%和82.0%。新疆细毛羊INHα亚基成熟区包括134个氨基酸,分子量约为14.7ku,含1个糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和7个半胱氨酸,氨基酸序列1-32区域存在抗原决定簇。 以本研究构建的pMD-INH克隆载体为模板,采用PCR技术,扩增出新疆细毛羊INHα亚基成熟区的编码基因(411bp),将纯化的PCR产物和表达质粒pET-32a(+)分别用限制性内切酶NcoⅠ和HindⅢ进行双酶切,回收目的片段,用T4 DNA连接酶将两者连接后转化到大肠杆菌DH5α中,筛选到INHα亚基重组原核表达质粒(pET-INH),经测序证实插入的DNA序列阅读框正确,无突变。在低温条件下(30℃),将携带有重组表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)通过IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小约为32ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blotting检测表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白,并用渗透压休克法获得了融合表达产物,表明使用这种方法获取INH免疫原的途径是可行的。