DNA修复相关基因甲基化与肺癌A549细胞顺铂化疗耐药的相关性

作     者：骆海军 

作者单位：贵阳医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：陶建蜀;张吉才

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：非小细胞肺癌 甲基化 甲基化特异性 PCR耐药 5-氮杂-2′脱氧胞苷 顺铂 

摘      要：目的用去甲基化试剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)处理非小细胞肺癌A549细胞株和其顺铂（cisplatin，DDP）耐药株A549/DDP，分别检测5-Aza-CdR干预前后A549细胞和A549/DDP细胞DNA修复相关基因hMLH1、MGMT启动子的甲基化状态及其表达，5-Aza-CdR与顺铂联合应用后A549/DDP细胞的IC50变化和凋亡状况，探讨hMLH1、MGMT基因启动子甲基化与肺癌细胞A549顺铂化疗耐药相关性。方法以A549/DDP细胞为研究对象，非小细胞肺癌A549细胞为对照，采用不同浓度5-Aza-CdR（0、5、10、20μmol/L）干预48小时后，甲基化特异性PCR（MSP）检测各组细胞hMLHl、MGMT基因甲基化状态,实时荧光定量PCR (real time fluorescencequantitative PCR,FQ-PCR)检测各组细胞hMLH1、MGMT基因mRNA的表达。采用四甲基偶氮唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium blue,MTT)法检测不同浓度DDP分别作用未经处理的A549/DDP细胞和20μmol/L5-Aza-CdR处理后A549/DDP细胞48h后的吸光度值，检测各组细胞生长抑制率;用流式细胞术测定不同浓度DDP作用未经处理的A549/DDP细胞和20μmol/L5-Aza-CdR处理后A549/DDP细胞48h后的细胞的凋亡率。结果（1）肺癌A549细胞hMLHl呈非甲基化状态，MGMT呈部分甲基化状态。A549/DDP细胞组hMLH1、MGMT均呈部分甲基化状态。10μmol/L5-Aza-CdR与20μmol/L5-Aza-CdR干预的A549/DDP细胞组hMLHl、MGMT基因均已完全去甲基化呈非甲基化状态。（2）荧光定量PCR测定A549和A549/DDP细胞发现hMLHl、MGMT基因mRNA均有不同程度表达，但A549/DDP细胞hMLHl、MGMT基因mRNA表达明显低于A549细胞，差异有统计学意义（P0.05），MGMT mRNA表达量与A549细胞组比较差异有统计学意义（P0.05）。（3）MTT法检测细胞增殖：A549组，A549/DDP组以及20μmol/L5-Aza-CdR处理后的A549/DDP组，用不同浓度顺铂作用48小时后的IC50值分别为3.50μmol/L、24.45μmol/L、10.72μmol/L，各组之间差异有统计学意义（P0.05）。由此表明20μmol/L5-Aza-CdR可以增强A549/DDP细胞对顺铂的化疗敏感性，但仍然不及其亲本细胞株A549细胞对顺铂的化疗敏感性。（4）流式细胞仪检测细胞凋亡率显示，20μmol/L5-Aza-CdR处理后的A549/DDP细胞组用5、10、40μmol/L DDP处理在48h小时后，凋亡率分别为：16.81％、26.09％、51.91％，未经5-Aza-CdR处理的A549/DDP组凋亡率分别为：7.26％、15.53％、35.16％，相应两组间比较比较差异均有统计学意义(P0.05)。也表明了5-Aza-CdR对A549/DDP细胞去甲基化可增强其对顺铂的化疗敏感性。结论hMLHl、MGMT基因启动子甲基化是A549细胞对顺铂化疗耐药的机制之一。5-Aza-CdR对A549/DDP细胞hMLHl、MGMT基因启动子去甲基化、增强hMLHl、MGMT基因mRNA的表达和对顺铂化疗的敏感性具有一定的作用。