PKM2与MST1相互作用抑制他莫昔芬诱导的人乳腺癌细胞凋亡

作     者：季飞虎 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈婷梅

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：他莫昔芬 M2型丙酮酸激酶 MST1 乳腺癌 细胞凋亡 

摘      要：目的:探讨4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)对M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase,PKM2)表达的影响,研究PKM2与MST1(Mammalian Sterile20-like kinase 1,MST1)相互作用的机制及其对MST1介导的人乳腺癌细胞MCF-7、SKBR3凋亡的影响。方法:1.4-OHT处理人乳腺癌MCF-7、SKBR3细胞及人正常乳腺上皮MCF-10A细胞后,流式检测4-OHT对MCF-7、SKBR3和MCF-10A细胞凋亡的影响,Western blot检测细胞PKM2、Cleaved-Caspase3以及MST1的表达情况。用4-OHT浓度梯度法长期诱导人乳腺癌MCF-7细胞,获得他莫昔芬耐药细胞株MCF-7R,并用CCK-8检测MCF-7和MCF-7R对4-OHT的药物敏感性,Western blot检测PKM2的表达。***-IP实验证明PKM2与MST1存在相互作用,并找出与PKM2作用的MST1的变构体,免疫荧光检测PKM2与MST1在细胞内定位情况。3.构建PKM2的shRNA慢病毒,感染乳腺癌MCF-7细胞株,用4-OHT诱导细胞凋亡,采用Western blot检测PKM2干扰后,乳腺癌细胞MCF-7和SKBR3中凋亡蛋白Cleaved-Caspase3和MST1蛋白的表达,核浆分离和免疫荧光实验检测细胞内MST1的分布情况。4.在4-OHT处理细胞的基础上,通过干扰或者过表达PKM2蛋白,同时过表达MST1,Western blot检测凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的表达,流式检测细胞凋亡发生的比例。结果:1.流式和Western blot结果表明,4-OHT能诱导乳腺癌细胞SKBR3和MCF-7发生凋亡,对正常乳腺上皮细胞MCF-10A凋亡没有影响;随着浓度的增高,PKM2表达逐渐减少,cl-Casepase3和cl-MST1逐渐增多。他莫昔芬耐药细胞株MCF-7R的PKM2表达量明显升高。***-IP结果显示MST1与PKM2存在相互作用,且与PKM2相互作用的MST1的变构体为cl-MST1,他莫昔芬能明显减弱此蛋白间的相互作用。免疫荧光实验显示,在MCF-7和SK-BR-3细胞中,PKM2与MST1主要共定位于细胞浆中。3.采用sh-PKM2慢病毒感染乳腺癌MCF-7细胞,Western blot实验结果表明PKM2的表达显著减少,cl-MST1增多,核浆蛋白分离实验和免疫荧光证实,PKM2干扰能够促进MST1剪切后入核,从而促进细胞的凋亡。*** blot结果表明,PKM2过表达能够抑制凋亡蛋白cl-Caspase3的表达,反之,PKM2干扰能够增强cl-Caspase3的表达。流式结果表明,PKM2过表达能够抑制MST1介导的细胞凋亡作用,反之,PKM2干扰能够增强MST1介导的细胞凋亡作用。结论:1.他莫昔芬促进乳腺癌MCF-7和SKBR3细胞凋亡,并且下调PKM2的表达,同时促进cl-MST1的表达。***1与PKM2存在相互作用,与PKM2相互作用的MST1的变构体为cl-MST1.3.干扰PKM2能够上调cl-MST1并促进其入核。***2抑制MST1介导的细胞凋亡,PKM2可能是MST1上游的调控乳腺癌细胞凋亡的重要靶点。