斑蝥纤溶活性蛋白的提取纯化及其作用性质研究

作     者：汪威 

作者单位：广东工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谭竹钧

授予年度：2011年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：斑蝥 分离纯化 纤溶活性蛋白 抗血栓 抗癌 

摘      要：本文首次从斑蝥体内提取纯化得到一种活性蛋白,并对其抗血栓和抗癌作用进行了初步的研究。采用硫酸铵盐析法对其蛋白质进行提取,用DEAE-32纤维素层析柱对所分离斑蝥蛋白粗提液进行纯化,得到相对分子质量约为95.5kD的单一组分蛋白。经检测,斑蝥活性蛋白具有纤溶活性,每毫克斑蝥活性蛋白相当于14.7尿激酶国际标准活力单位,其蛋白浓度为***-1,糖含量为11.084%。 本实验还研究了不同理化因素对斑蝥活性蛋白的影响。该活性成分在35℃下最稳定,65℃及以上活性丧失,金属离子K+、Na+对其活力无影响,Mn2+、Ca2+对其有明显抑制作用,1%的SDS和1%的巯基乙醇则可完全抑制其活力。最适pH为6.0-7.0。实验还对斑蝥活性蛋白进行了红外吸收检测,结果表明,斑蝥虫活性蛋白可能是一种含有糖结构的蛋白质。 实验还采用急性毒性实验对斑蝥活性蛋白的安全性进行初步研究,结果表明斑蝥活性蛋白安全。同时对斑蝥活性蛋白的溶血性做了检测,其溶血率小于5%,不引起体外红细胞的明显溶血,安全性好。对斑蝥活性蛋白进行体外溶栓实验,结果表明其具有溶栓作用,并且血凝块的溶解率随着斑蝥活性蛋白浓度的增加而增加。 血栓与恶性肿瘤转移关系密切。因此,本文通过斑蝥活性蛋白对乳腺癌细胞(MCF-7),肺癌细胞(A549)和小鼠腹水瘤细胞(S180)的抑制作用实验,MTT法测定斑蝥纤溶活性蛋白对以上细胞体外增殖的影响,纤溶活性蛋白按照不同浓度分别作用于细胞24h和48h,结果显示其中对S180、A549细胞细胞的抑制效果较好,对MCF-7细胞抑制作用不明显,由此显示斑蝥纤溶活性蛋白对于肿瘤细胞的抑制作用具有选择性。然而它含有的溶栓活性蛋白组分是否有直接杀伤肿瘤细胞的作用、其抑制作用机理等尚待进一步研究。另外,它的抑制血管生成作用具体途径及其机制也还需进一步研究加以证实。