大肠杆菌烷基过氧化氢还原酶（AhpF-AhpC）的结构与功能研究和大肠杆菌YcjY蛋白的结构与功能研究

作     者：陈超飞 

作者单位：安徽大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘全胜;董宇辉

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

主      题：烷基过氧化氢还原酶 构象变化 YcjY α/β水解酶 催化二联体 丝状表型 

摘      要：烷基过氧化物还原酶(AhpR)系统还原细胞内各种过氧化物底物,具有解毒功能,因而在细菌中起重要作用。AhpR能够保护细胞抵抗氧化压力,是通过烷基过氧化氢还原酶的两个亚基实现-AhpF和AhpC。AhpC是一个典型的2-cys过氧化物还原酶(peroxiredoxin),它能够直接将过氧化物底物转化为水或相应的醇,从而起到解毒作用。AhpF是一个黄素蛋白,特异性催化AhpC蛋白,把NADH上的电子转移到AhpC上来再生AhpC。电子从最初的NADH转移到最终的AhpC上,AhpF上有三个催化中心参与电子转移过程：一个N-端氧化还原结构域(NTD),一个FAD结合结构域(FAD结构域)和一个NADH结合的氧化还原结构域(NAD结构域)。目前认为AhpF的调控机制和硫氧还蛋白还原酶-硫氧还蛋白系统(TrxR-Trx)类似。首先,电子在AhpF蛋白分子内部传递,结合在NAD结构域上的NADH把电子传递给FAD结构域的辅酶,辅酶FAD再传递给NAD结构域氧化还原中心Cys345-Cys348,随后电子传递给NTD结构域的Cysl29-Cysl32。最后,电子在AhpF与AhpC分子之间传递,电子从AhpF的结构域NTD (Cysl29-Cysl32)传递给二聚体AhpC的氧化还原中心Cys47-Cys166上。在上述电子传递过程,AhpF中NAD结构域Cys348作为亲核基团攻击NTD结构域Cys129,然后Cys129作为亲核基团攻击AhpC中的Cys166,完成氧化还原催化反应。AhpF蛋白在催化过程中经历剧烈的构象变化,一方面,NTD结构域的Cysl29-Cysl32和NAD结构域Cys345-Cys348需要相互接触接受来自NADH的电子;另一方面,NTD结构域Cysl29-Cysl32需要和AhpC接触。因此NTD结构域需要经历构象变化,以便将电子传递给AhpC蛋白。本论文中,我们纯化了***的内源AhpF蛋白,获得了AhpF蛋白的晶体结构(分辨率为2.2A)。从整体结构来看,AhpF呈现为一个全新的开放构象,它的N-端结构域远离C-端结构域,这一构象和来自鼠伤寒沙门氏菌高度同源蛋白StAhpF和最近报道的大肠杆菌的EcAhpF构象均不相同。我们的实验结果表明,AhpF可能采用一个开放状态去更高效的催化十聚体的AhpC,完成过氧化物的解毒功能。我们在AhpF晶体结构中捕捉到开放的构象可能是AhpF进行分子间电子传递的中间态。肽聚糖是细菌细胞壁中重要和独特的组分,位于细胞质膜外,它的主要功能是通过抵抗高渗透压来保持的的完整性和保持细胞形态。在肽聚糖代谢过程中,PgrR是一个转录因子,它作为一个阻遏蛋白调控参与肽聚糖寡肽降解基因的表达,它可以直接结合到pgrR上游和反向ycjY-ymjD-ymjC-mpaA基因簇之间的操纵子上,调控ycjY-ymjD-ymjC-mpaA基因簇的表达。最近有报道说,过量表达ycjY-ymjD-ymjC-mpaA基因簇中的未知水解酶ycjY能够导致大肠杆菌细胞变长呈丝状表型,推测YcjY可能在大肠杆菌细胞生长和分裂过程中起作用。事实上,肽聚糖水解酶对细胞形状和生长状况有重大影响。本论文我们解析了大肠杆菌YcjY蛋白的晶体结构(分辨率2.0A)。YcjY的单体结构呈现出一个经典的α/β水解酶折叠,它可以分为两部分：一个核心催化结构域和一个插入(insertion)结构域。核心催化结构域有一个中心8β折叠,大部分是平行的p折叠,其中β2是反向平行的。中心p折叠两侧是a螺旋,一侧是α1,α111和α12,另一侧是α2,α3和α10。中心p折叠呈现出一个左手超螺旋扭转,β1和p10呈90℃。插入区域(insertion)位于中心p折叠的β6和β9之间的loop上。插入区域由一个小的反平行p-发夹(β7/β8)和6个a-螺旋(α4,α5,α6,α7,α8和α9)组成,它们共同组成一个位于核心催化结构之上的帽子结构。我们通过凝胶过滤层析研究了YcjY在溶液中的聚集状态,它表现出一个单一的峰,层析峰对应分子量大小为58.88 kDa,表明它在溶液中以二聚体形式存在(单体是33.7 kDa)。与其他a/p水解酶相比,我们确定了YcjY作为半胱氨酸水解酶的催化位点,通过细胞表型实验确定了这些位点的重要性。我们还发现,YcjY的功能可能受到在同一操纵子基因ymjD, ymjC和]mpaA的拮抗效应影响。综上所述,YcjY可能作为一个新的α/β水解酶,参与到肽聚糖寡肽水解和肽聚糖生物合成过程。