miR-223在日本血吸虫感染免疫调节中的作用分析
作者单位：上海师范大学
学位级别：硕士
导师姓名：赵梅君;林矫矫
授予年度：2017年
学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
摘 要：日本血吸虫病(schistosomiasis)流行广泛、危害严重,是我国重大的公共卫生问题之一。日本血吸虫可感染40多种哺乳动物宿主,不同宿主对血吸虫感染的适宜性存在较大的差别。不同宿主有着独特的机体内环境,会影响日本血吸虫的生长发育、雌雄合抱和虫卵形成,最终影响虫体在宿主体内的存活状态及宿主的病理变化。microRNAs为近年来发现的一类小分子非编码RNA,它在包括免疫应答在内的许多生物学过程中均发挥重要的转录后调控功能。micro RNA 223(miR-223)是一种在髓系细胞中特异高表达的miRNA,前期研究表明,不同适宜性宿主感染日本血吸虫后,miR-223表达水平呈现较大差别,可能在宿主抗血吸虫感染天然免疫中发挥重要的作用,但对其调节机制等仍了解甚少。本文比较分析了不同易感性宿主感染日本血吸虫后miR-223的表达差别,再深入分析了血吸虫童虫抗原SSA和虫卵抗原SEA等抗原刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7后miR-223的表达差别,及巨噬细胞转染miR-223模拟物后,对SSA和SEA抗原刺激的调节作用。研究结果为加深理解宿主miR-223在抗血吸虫感染天然免疫中的调节作用提供了理论基础。1.不同易感宿主在血吸虫感染早期miR-223的表达水平分析分别用日本血吸虫尾蚴感染易感宿主BALB/c小鼠、非易感宿主Wistar大鼠和抗性宿主东方田鼠,在感染后3d、7d和10d收集血清,应用荧光实时定量PCR法测定了不同宿主在血吸虫感染前和感染后不同时期里miR-223的表达情况。结果显示不同易感性宿主感染血吸虫后miR-223表达呈现明显的差别,小鼠感染血吸虫后miR-223的表达水平呈上升趋势,大鼠先上升后略有下降,而东方田鼠则呈下降趋势。另从miR-223的总体表达水平看,感染日本血吸虫的小鼠一直高于大鼠,而大鼠一直高于东方田鼠。研究结果提示miR-223可能在不同适宜性宿主抗血吸虫感染中发挥独特的调节作用,并影响着日本血吸虫在不同适宜性宿主体内的生长发育及存活。2.不同抗原刺激巨噬细胞后miR-223的表达水平分析分别以血吸虫童虫抗原SSA、虫卵抗原SEA和三种TLR配体刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,分析不同抗原刺激后miR-223的表达变化。结果表明POLY(I:C)(TLR3受体配体)和LPS(TLR4受体配体)刺激巨噬细胞后都下调了miR-223的表达,而PAM3CSK4(TLR2受体配体)刺激后上调了miR-223的表达。血吸虫童虫抗原SSA和虫卵抗原SEA刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7后,前者下调了miR-223的表达,而后者则起上调作用,提示SSA和SEA刺激巨噬细胞时,miR-223可能通过不同的TLR信号通路发挥调节作用。***-223对血吸虫抗原刺激巨噬细胞的调节作用分析为明确miR-223对SSA和SEA刺激巨噬细胞的调节作用,先用miR-223模拟物转染RAW264.7巨噬细胞,再分别用SSA或SEA刺激,进而分析巨噬细胞转染/刺激后部分TLR受体及其相关通路分子、炎性分子、巨噬细胞表面分子和i NOS等的表达变化。结果显示,单用SEA刺激巨噬细胞时,TLR1、2、3、4的表达都呈现不同水平的上调,其中TLR2和TLR1表达水平差异显著(P0.05),TLR通路分子My D88表达下调,而TRIF表达上调,IL-1β、IL-10、IL-6和TNF四种炎性因子都呈不同水平上调。而单用SSA抗原刺激时,TLR4和TLR1的表达上调显著(P0.05),TLR2表达则显著下调,My D88表达上调,TRIF表达水平下调,IL-1β和IL-10表达水平上调,TNF表达略有下调,IL-6表达水平变化不明显。提示SEA和SSA识别和激活的巨噬细胞TLR分子和通路分子,及诱导产生的免疫效应分子可能有差别,在刺激和诱导宿主抗血吸虫感染和血吸虫致病过程中可能也发挥不同的作用。当先用miR-223模拟物转染细胞,再用SEA刺激细胞时,除TLR2与未刺激细胞表达水平相当外,TLR1、3、4表达水平都低于未刺激细胞,其中TLR4下调最明显。通路分子中My D88表达水平上调,TRIF表达水平下调。炎性因子中IL-6、IL-1β、IL-10呈上调表达,而TNF表达下调。但相对单用SEA刺激,巨噬细胞各种炎性因子的表达都呈不同程度下调,其中IL-6下调最明显,其次是IL-1β。提示miR-223对SEA刺激巨噬细胞TLR1、2、3、4可能有负调控作用,对My D88可能有正调控作用,而对TRIF则起负调控作用,同时诱导了IL-6、IL-1β、IL-10和TNF呈下调表达。而miR-223模拟物先转染巨噬细胞,再用SSA刺激细胞时,除了TLR4显著上调(P0.05),其余3种TLR的表达水平都下调。其中相对于单
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