肝郁脾虚证大鼠十二指肠和下丘脑CCK、CCK1R变化及逍遥散的调节作用

作     者：王方方 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈家旭

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：肝郁脾虚证 慢性束缚应激 下丘脑 胆囊收缩素 脑肠肽 逍遥散 

摘      要：研究背景肝郁脾虚证是中医常见证候,其生物学基础尚不完全明确。现代医学研究认为情志变化是肝郁脾虚相关疾病的病因学基础,情志反应作用轴为神经中枢-丘脑下部-脑干植物神经系统-效应器,当肝气久郁、疏泄失司时,机体对于情志变化产生的反应,可导致机体大脑神经中枢功能紊乱,使皮层下中枢兴奋,通过植物神经的传递而使机体各系统器官发生相应的功能和器质性变化。到肝郁脾虚证阶段,往往还可导致其它如消化系统、神经系统、胃肠功能等方面的变化,因而能同时调节情志和摄食的脑肠肽成为了目前肝郁脾虚证候研究的热点之一。脑肠肽(Brain gut peptide,BGP)是双重分布在神经中枢和胃肠道的一类神经递质,是认知和情感中枢与神经内分泌、内分泌和免疫系统相联系的双向交通通路的分子基础,其在调节情志、记忆、内脏感觉、分泌、运动中起着重要作用。BGP也是参与食物摄取的重要的胃肠激素,在脑肠轴调控摄食行为中起关键的作用。胆囊收缩素(Cholecystoki-nin,CCK)作为一种典型的脑肠肽,是由小肠I型细胞及神经元进食后分泌的,广泛分布于胃肠道(十二指肠、空肠及结肠)和中枢及外周神经系统中,并以神经递质的形式发挥重要的生理作用。CCK不仅在胃肠功能调节方面扮演着重要的角色,在中枢神经系统中尤其是在情志和食欲调节方面也起着重要作用。逍遥散是中医治疗肝郁脾虚血弱的经典方剂,已被广泛应用于肝郁脾虚证的相关研究中。本课题组前期实验研究表明,以21天慢性束缚应激复制肝郁脾虚证动物模型,用逍遥散干预后,可对肝郁脾虚证起到显著的调节作用,其作用机制可能与调节多种BGP有关。但逍遥散是否能通过调整CCK与CCK1R的中枢-外周网络而改善肝郁脾虚证,目前尚不明确。研究目的本课题立足于肝郁脾虚与脑肠肽的关系,采取21d慢性束缚应激的方法复制肝郁脾虚证病证结合大鼠模型,从动物的一般状态、行为学表现、宏观表征(摄食量,体重)以及微观指标等方面对模型大鼠进行观察评价。运用分子生物学技术,从基因、蛋白层面上检测大鼠十二指肠和下丘脑CCK及其受体的表达变化,同时以方测证,观察中药复方逍遥散对待测部位指标的调节作用。通过观察慢性束缚应激状态下CCK和CCK1R在中枢和外周神经的变化,以期探讨肝郁脾虚证发病的中枢-外周微观机制,为诠释肝郁脾虚证的科学内涵充实理论基础,从而为逍遥散在临床的疗效评定提供依据。研究方法选用成年SD雄性大鼠80只,适应性饲养一周后按随机数字表法分为正常组(A组)、模型组(B组)、氟西汀组(C组)、逍遥散组(D组),共4组,每组20只,5只一笼。本实验沿用课题组慢性束缚应激的方法复制肝郁脾虚证大鼠模型,A组大鼠每日不予束缚和干预措施,自由饲养;B、C、D三组大鼠每日将其捆绑于特制的束缚架上,限制其自由,束缚时间点随机,3h/d;束缚结束后同一时间段进行灌胃,其中C组大鼠灌服氟西汀2mg/kg体重,D组大鼠灌服逍遥散2.224g/kg体重,B组大鼠灌服等剂量的去离子水,造模持续21天。实验期间观察各组大鼠的一般状态、进食量、体重等变化情况,运用糖水偏好实验、强迫游泳实验、旷场实验对大鼠行为学进行评价;采用实时荧光定量PCR和免疫组化的方法,观察各组大鼠十二指肠和下丘脑中CCK、CCK1R的含量及相应的基因蛋白表达变化。研究结果大鼠暴露于慢性束缚应激状态下逐渐出现情绪低落、毛发枯黄脱落、倦怠少动嗜卧、大便臭秽且干湿不调等肝郁脾虚的表现,同时出现摄食量减少、体重减缓等宏观状态的变化。造模第21天,模型组大鼠的体重和摄食量均明显低于正常组、氟西汀组、逍遥散组大鼠(P0.01),说明慢性束缚应激影响了大鼠的食欲和体重的变化。在糖水偏好实验、旷场实验和强迫游泳实验中,模型组大鼠出现了糖水摄入量明显降低(P0.01),站立次数、穿格次数、修饰次数的显著减少(P0.01),5分钟内不动时间的显著延长(P0.01),说明慢性束缚应激使模型大鼠出现了情志抑郁的行为改变,表现出兴趣减退、快感缺失、绝望无助等行为,而氟西汀组和逍遥散组大鼠的各项行为学指标都明显改善。RT-qPCR结果显示,与正常组相比,肝郁脾虚证模型组大鼠十二指肠和下丘脑CCK及CCK1R的mRNA表达水平明显升高(P0.01)。相比模型组,经过药物干预后,氟西汀组和逍遥散组大鼠十二指肠和下丘脑中CCK及CCK1R的mRNA表达显著下调(P0.01)。免疫组化结果显示,外侧区和腹内侧核两个核团上有众多CCK的阳性棕色颗粒分布,模型组大鼠下丘脑和十二指肠的CCK及其受体CCK1R的表达水平较正常组明显升高,表明其不仅影响情绪,而且还影响着食欲和胃肠动力。与模型组相比,经药物干预后,氟西汀组和逍遥散组大鼠十二指肠和下丘脑的CCK及CCK1R的蛋白表达量则显著下调,从而进一步证实了 RT-qPCR的结果。结论本研究通