EML4-ALK阳性H2228细胞中SOCS1和SOCS3基因启动子区甲基化状态及其作用的研究

作     者：刘春来 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘红雨;陈军

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肺癌 微管相关蛋白样4 人间变性淋巴瘤激 细胞信号转导抑制因子1 细胞信号转导抑制因子3 信号传导及转录激活因子3 信号传导及转录激活因子6 DNA甲基化 

摘      要：背景和目的:人类棘皮动物微管相关蛋白样4和人类间变性淋巴瘤激酶融合基因EML4-ALK是新发现的非小细胞肺癌的驱动基因,具有独特的临床病理生理特征。ALK基因下游信号通路的异常持续激活是其重要的下游信号通路,而导致其下游基因持续激活的原因不明。细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling,SOCS）是一类在细胞信号转导过程中起重要作用的负调控因子,主要通过抑制JAK蛋白酪氨酸激酶（janus protein tyrosine kinase,JAK激酶）信号传导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription,STAT）即JAK-STAT等信号通路来调控细胞的增殖、分化和凋亡。肿瘤中常存在SOCS基因的甲基化异常导致的失活,从而导致JAK2-STAT等信号通路持续异常活化。本研究的目的在于探讨SOCS1和SOCS3对EML4-ALK融合基因阳性肺癌细胞的影响及其SOCS1和SOCS3启动子区的甲基化情况。方法:甲基化特异性PCR检测EML4-ALK阳性H2228肺癌细胞及肺癌组织中SOCS1和SOCS3启动子区的甲基化状态,并通过测序进行验证。DNA甲基转移酶抑制剂5’-Aza-d C处理H2228细胞,并通过real-time PCR和Western blot检测SOCS1和SOCS3的表达水平变化。ALK抑制剂TAE684、ALK-Si RNA处理H2228细胞,抑制ALK表达,Western blot检测p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6、SOCS1和SOCS3的表达水平变化。在EML4-ALK阴性表达的HEK293细胞中过表达ALK后,Western blot检测JAK-STAT信号通路的活化情况及SOCS1和SOCS3的表达水平变化。用p EGFp-SOCS1和p EGFp-SOCS3质粒转染H2228细胞,通过RT-PCR和Western blot检测SOCS1和SOCS3的表达水平变化,检验转染效果,并用EDU、CCK8和流式细胞计数检测细胞的增殖能力和细胞周期的变化情况。结果:对7例EML4-ALK阳性肺癌患者肿瘤组织和EML4-ALK阳性细胞H2228进行甲基化特异性PCR反应,结果表明H2228细胞和所有的7例EML4-ALK阳性肺癌组织中都存在SOCS1启动子区的部分甲基化,H2228细胞和7例组织中的3例存在SOCS3基因启动子区的部分甲基化。Real-time RCR和Western-Blot结果也证明DNA甲基转移酶抑制剂5’-Aza-d C去甲基化处理H2228细胞后SOCS1和SOCS3表达上调。HEK-293细胞过表达ALK 48h后,JAK-STAT信号通路被激活,ALK和p-ALK蛋白水平的表达明显增高,伴随着ALK和p-ALK的表达增强p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表达也随之增加。分别用ALK-Si-RNA和ALK抑制剂TAE-684处理H2228细胞后,ALK和p-ALK蛋白水平的表达明显降低,并且p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表达也都降低,JAK-STAT信号通路受到抑制。对H2228细胞进行p EGFp-SOCS1、p EGFp-SOCS3转染处理后,H2228细胞中SOCS1和SOCS3的表达在转录水平上较对照组相比分别增高了10.3倍和93.4倍。Western-Blot结果示转染SOCS1的H2228细胞中SOCS1的表达明显增高,而转染SOCS3的H2228细胞SOCS3表达也明显增高,亦表明转染是成功的。随着SOCS1和SOCS3的表达明显增加,我们发现两组细胞中p-ALK、p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表达均有所降低,说明JAK-STAT信号通路受到抑制。EDU的实验结果表明H2228细胞在转染SOCS1和SOCS3后,其细胞增殖能力都要明显低于转染空载体的H2228细胞。统计学结果显示对照组细胞活力56.25%,p EGFp-SOCS1组细胞活力36.45%（P0.05）,p EGFp-SOCS3组细胞活力38.72%（P0.05）。CCK-8结果与EDU结果一致,H2228细胞过表达SOCS1和SOCS3后与对照组相比,细胞代谢活性抑制率分别为48.49%（P0.05）和58.33%（P0.05）。FCM进行细胞周期分析,对照组与实验组G1期和S期细胞数量基本没有差异,但是两个实验组G2期细胞的数量均明显高于对照组,统计学结果显示两个实验组P值均小于0.05。结论:EML4-ALK（+）的H2228细胞及部分肺癌组织中存在SOCS1和SOCS3启动子区的异常甲基化;HEK293细胞中过表达ALK