组蛋白去甲基化酶RBP2在人胃癌血管生成中的关键作用

作     者：李禄鹏 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾季平

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：RBP2 VEGF 胃癌 血管生成 

摘      要：研究目的：在世界范围内,胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,在胃癌的癌变过程中,遗传和表观遗传的改变可以导致癌症的渐进转化。本文研究了组蛋白去甲基化酶RBP2对人血管内皮生长因子(VEGF)的调控机制,从而丰富了RBP2参与肿瘤恶性进展和血管生成的机制,确定这一分子机制对胃癌的诊断和治疗有一定潜在作用。研究方法：1、在组织水平上,用实时定量PCR和免疫组织化学的方法检测了27对(胃癌组织和癌旁正常组织)标本中RBP2、VEGF的水平,通过对比RBP2和VEGF在胃癌和癌旁组织中的表达水平,初步确定两者之间的正相关性。我们还在这些组织中检测了表征微血管密度(MVD)的标志物CD31和CD34、表征细胞增殖的标志物Ki67,进一步分析了RBP2与这几个分子之间的相关性。2、在分子水平上,我们利用RBP2的高表达质粒和RBP2的小干扰RNA转染胃癌细胞系,检测其对血管内皮生长因子(VEGF)在mRNA水平和蛋白水平表达的影响,同时我们检测了高表达和干扰RBP2分子对细胞内H3K4me2和H3K4me3表达水平的影响。我们又发现在VEGF的启动子区包含有RBP2的调控下游基因表达的靶序列CCGCCC,我们构建了VEGF的启动子质粒和突变质粒,通过双荧光素酶实验和ChIP实验证实了RBP2可以通过VEGF启动子区序列CCGCCC直接结合到VEGF的启动子区。我们又检测了高表达和干扰RBP2处理后,胃癌细胞系的克隆形成能力和其条件培养基对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)微管形成能力的影响。3、在动物水平,我们首先取野生型小鼠、杂合RBP2敲除鼠、纯合RBP2敲除鼠的胃部组织,通过实时定量PCR和免疫组化的方法,检测VEGF的mRNA水平和蛋白水平的变化。然后我们在裸鼠皮下注射RBP2稳定干扰的胃癌细胞系BGC-823,实时监测肿瘤的形成和体积变化,15天后麻醉处死,分离瘤组织,通过Western Blotting的方法检测RBP2的敲除效果,利用免疫组化检测VEGF、CD31、CD34 和 Ki67的表达水平。结果：1、与正常组织相比,胃癌组织中RBP2和VEGF均高表达,微血管密度(MVD)和细胞增殖也更明显。2、在胃癌上皮细胞系中高表达RBP2之后,VEGF的mRNA水平和蛋白水平有明显的升高,干扰RBP2有相反的效果。3、在野生型小鼠、杂合RBP2敲除鼠、纯合RBP2敲除鼠的胃部组织中,检测VEGF的mRNA水平和蛋白水平的变化呈逐步降低的趋势,CD31、CD34和Ki67也呈现逐渐降低的趋势,说明敲除RBP2对血管形成和细胞增殖有显著的抑制作用。4、通过双荧光素酶实验和免疫共沉淀实验(ChIP)证实了RBP2可以通过CCGCCC序列直接结合到VEGF的启动子区,进而作为转录因子调控VEGF的表达水平。5、在胃癌上皮细胞系中,通过克隆形成实验及回复实验,证实RBP2表达显著促进胃癌细胞的克隆形成能力;通过微管形成实验证实,高表达RBP2细胞的条件培养基可以显著诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的微管形成。6、裸鼠皮下注射RBP2稳定干扰的BGC-823细胞,通过对瘤体体积的实时监测发现,RBP2的敲除可以显著抑制胃癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力;通过对瘤体的免疫组化检测发现,和对照组相比,RBP2稳定干扰组的VEGF、CD31、***67蛋白的表达水平均降低,表明在整体动物水平,RBP2的稳定干扰可以降低微血管密度,抑制肿瘤细胞增殖,从而证明RBP2对VEGF的调控作用。结论：RBP2可以促进胃癌肿瘤发生和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并促进血管生成。RBP2和活化的血管内皮生长因子(VEGF)的过度表达可能在胃癌的发生发展中起着重要的作用。