地锦（Parthenocissus tricuspidata）的遗传转化及抑菌活性研究

作     者：刘华玲 

作者单位：中国科学院研究生院（成都生物研究所） 

学位级别：硕士

导师姓名：马欣荣

授予年度：2007年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：地锦 根癌农杆菌 遗传转化 转录因子DREB 高盐耐受力 脯氨酸 抑菌作用 正丁醇提取物 最低抑菌浓度(MIC) 

摘      要：地锦(Parthenocissus tricuspidata)为葡萄科(Vitaceae)地锦属(Parthenocissus)多年生大型落叶木质藤本植物，集绿化、环境保护、药用价值为一体，开发利用前景非常广阔。为了进一步有效地利用及增加它的适应性，本论文对地锦的遗传转化及其抑菌活性进行了初步研究。 利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导对地锦进行遗传转化。所转外源目的基因为干旱应答因子结合蛋白DREB基因，克隆自拟南芥，受干旱应答基因启动子rd29Bp驱动。将此基因与pCAMBIA2301重组构建得到植物表达载体p2326。p2326携报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)和选择基因新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)。然后将p2326导入根癌农杆菌EHA105，对地锦愈伤组织及外植体茎段进行转化。经3-4轮卡那霉素选择培养后，PCR及GUS组织染色验证，表明成功获得了转基因愈伤组织。 对地锦愈伤组织进行耐盐及脯氨酸含量测定。结果表明，转基因愈伤组织与非转基因愈伤组织相比，对高盐的耐受力有较大提高。在250 mMNaCl的继代培养基中，携DREB基因的愈伤组织能够存活20 d以上，而对照在10 d后大多数褐化死亡。高盐胁迫时转基因材料脯氨酸含量高于对照，并能够维持较长时间。 研究还发现，来自室外自然生长的地锦茎、叶，对根癌农杆菌有极强的抑制作用。因此，对地锦的抑菌作用进行初步研究。 对一年中不同时期(分别采于4月、8月、12月)的地锦茎、叶进行抑菌活性初步研究。结果表明，12月份地锦叶片对所选细菌抑制作用最强。然后对其进行分溶剂萃取。分别用极性递增的有机溶剂依次提取地锦中的有效成分、逐级分离、浓缩干燥，得到石油醚部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部等不同极性溶剂萃取物。选择革兰氏阳性菌和阴性菌共5种对得到的各部分粗提物分别做抑菌实验，表明正丁醇部的抑菌活性最强，水部提取物有一定抑制作用，而石油醚部、乙酸乙酯部没有表现出明显抑菌作用。 地锦正丁醇提取物对大肠杆菌、枯草杆菌、短小芽孢杆菌、农杆菌及酵母菌的最低抑制浓度(MIC)分别为0.25，0.3，0.25，0.3，1g／mL。其抑菌活性随着浓度增加而增强，而且抑菌活性具有较好的热稳定性。 研究发现地锦所产生的抑菌物质不仅对无耐药性的细菌具有抑制作用，而且还对某些耐药性细菌具有抑制作用。目前，细菌对抗生素的耐药性已成为全球关注的问题，寻找新型抗生素已迫在眉捷，地锦抑菌物质的研究为新抗菌药物的研制开发提供了新思路。 上述研究结果，为地锦的遗传改良及开发利用打下基础。