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Gln及其二肽对氧化应激下山羊瘤胃上皮细胞凋亡及其机制的研究

Gln及其二肽对氧化应激下山羊瘤胃上皮细胞凋亡及其机制的研究

作     者:韩奇鹏 

作者单位:湖南农业大学 

学位级别:硕士

导师姓名:张佩华;周传社

授予年度:2016年

学科分类:0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题:Gln Ala-Gln Gly-Gln 氧化应激 湘东黑山羊 瘤胃上皮细胞 凋亡 

摘      要:本研究应川原代细胞分离技术、传代细胞培养模型、氧化应激模型、实时荧光定量PCR (RT-qPCR)、免疫组化学等技术进行体外试验,同时结合动物临床医学研究进展,从细胞与分子水平探讨谷氨酰胺(Gln)及其二肽对断奶山羊瘤胃上皮细胞抗氧化应激的影响,掌握G1n及其二肽与断奶山羊瘤胃上皮细胞凋亡关系,进而为揭示G1n及其二肽对H202诱导断奶山羊瘤胃上皮细胞氧化应激调节作川机制和进一步深入研究提供理论依据。试验一 湘东黑山羊瘤胃上皮细胞周期分布、增殖和凋亡特点研究本研究旨在为建立湘东黑山羊瘤胃上皮细胞体外培养模型,并对其凋亡比率进行初步研究。试验采集60日龄湘东黑山羊的瘤胃上皮组织,应用0.25%胰蛋白酶(Trypsin)+0.02%乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, EDTA)对山羊瘤胃上皮组织进行消化,得到单个的山羊瘤胃上皮原代细胞进行体外培养。通过倒置显微镜观察原代和传代培养阶段山羊瘤胃上皮细胞形态,采用细胞计数法检测山羊瘤胃上皮传代细胞的生长活性;应用细胞免疫组化学方法对山羊瘤胃上皮传代细胞进行鉴定;并用流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)检测山羊瘤胃上皮传代细胞周期分布情况和凋亡比率。结果显示:1)经0.25%Trypsin+0.02% EDTA消化获得的山羊瘤胃上皮原代细胞,培养1d后开始贴壁生长,2d开始生长较快(对数期)呈典型的“波峰状生长,3-7d生长最为迅速,7-8d生长速度平稳(平台期),8-9d后进入生长衰退期;2)经免疫细胞化学方法鉴定,细胞胞浆为黄褐色,即细胞角蛋白19呈阳性(CK19)表达;3)膜联蛋白-V (Annexin V)/碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)联合染色显示,随着培养时问的延长,细胞凋亡比率显著增加(P0.01)。试验表明,通过0.25%Trypsin+0.02% EDTA的消化方法成功得到了山羊瘤胃上皮细胞,为后面研究反刍家畜瘤胃上皮细胞相关机制与功能提供了技术支持和理论参考。试验二H202诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡的影响试验采用单因子试验设计,共4个处理,即在离体的山羊瘤胃上皮细胞中分别添加终浓度0、100、400、800μM的H202,每个处理3个重复。结果表明:与对照组相比,当H202浓度增加到800μM时,早期凋亡显著增加(P0.01);而晚期凋亡随着H202浓度的增加呈现先增加后减少的趋势但相对于对照组,都均呈显著增加(P0.01)。这说明H202可以诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡的增加。试验三G1n及其二肽对山羊瘤胃上皮细胞凋亡的影响试验采用单因子试验设计,分离培养断奶山羊瘤胃上皮细胞,向细胞培养液中添加Gln (16.0mM)、Ala-Gln (16.0mM)和Gly-Gln水平(17.28mM),试验共设3个处理,每个处理3个重复;并添加5个处理的G1n及其二肽(0、800(H2O2) μM、17.28(GG)mM+800(H2O2)μM、16(G)mM+800(H2O2)μM、16(AG)mM+800(H2O2μM)。应用膜联蛋白-V/PI联合染色的结果显示:(1)与对照组相比,G组和GG组早期细胞凋亡显著降低(P0.01),这说明添加G1n和Gly-Gln可以减少山羊瘤胃上皮传代细胞早期凋亡率;(2)与(C (H2O2))组相比,GG+C(H2O2)组晚期细胞凋亡显著降低(P0.01),说明添加Gly-Gln可缓解H202对山羊瘤胃上皮细胞氧化应激的损伤。实验四G1n及其二肽对H202诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡基因Bcl-2/BaxmRNA表达的影响本试验采用单因子试验设计,向山羊瘤胃上皮细胞中添加5个处理的G1n及其二肽(0、800(H2O2)μM、17.28(GG)mM+800(H2O2)μM、16(G)mM+800(H2O2)μM、 16(AG)mM+800(H2O2μM),检测山羊瘤胃上皮传代细胞凋亡基因Bcl-2/Bax mRNA表达量。采集60日龄湘东黑山羊的瘤胃上皮传代细胞,采用荧光定量(real time quantitative polymerase chain reareaction, RT-qPCR)对山羊瘤胃上皮传代细胞凋亡基因Bcl-2/Bax表达量进行检测。实验结果显示:(1)与对照组比较,添加H202显著降低Bcl-2基因表达量(P0.01),而Bax基因表达量显著增加(P0.01), Bcl-2/Bax比值显著降低(P0.01);(2)在添加H2O2基础上,添加Gln、Gly-Gln和Aln-Gln,与C(H2O2)组相比,导致Bax基因表达量显著降低(P0.01),而Bcl-2基因表达显著增加(P0.01),Bcl-2/Bax比值显著增

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