黄瓜徒长苗特征及相关基因CKO的克隆与表达分析

作     者：胡宏敏 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴震

授予年度：2012年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：黄瓜 徒长 生长指标 超微结构 贝壳杉烯氧化酶 表达 

摘      要：黄瓜(Cucumis sativus L.)是普遍栽培的世界性蔬菜,也是重要的设施蔬菜,在市场供应中占有重要的地位。黄瓜主要采用育苗栽培,但在育苗过程中,如果遇到高温高湿、光照不足、水分过多等环境不适情况时,秧苗易徒长,导致幼苗质量下降,进而对定植后植株的营养生长和生殖生长产生影响,最终影响产量和品质。植株幼苗的过度生长是以赤霉素(gibbereilin, GA)为中心的激素不平衡造成的。植物中GA生物合成或信号转导增强时,会呈现相应长的下胚轴表型,形成徒长苗。贝壳杉烯氧化酶基因(KO)是目前研究相对较多的GA生物合成限速酶基因,但黄瓜KO的克隆还未见报道。本试验以黄瓜品种‘戴多星’为试材,克隆到赤霉素合成的关键酶-贝壳杉烯氧化酶(KO)基因cDNA全长序列,比较了正常光温条件、正常温度结合黑色遮阳网遮光及正常温度结合黑色遮阳网遮光同时喷施多效唑3个处理下,生长指标、下胚轴细胞的超微结构和CKO的表达水平的差异,并通过农杆菌介导得到转基因初代烟草植株,为黄瓜徒长机理的研究提供理论基础。主要结果如下： 1.以黄瓜品种‘戴多星’为试材,研究正常光温条件、正常温度结合黑色遮阳网遮光及正常温度结合黑色遮阳网遮光同时喷施多效唑对黄瓜幼苗生长状态及下胚轴细胞超微的影响。结果表明：相比于正常条件下的幼苗,遮光使黄瓜幼苗下胚轴长度显著增加,下胚轴粗显著降低,干重显著减少,壮苗指数下降,表现出明显的徒长状态。喷施多效唑能有效的控制幼苗徒长,提高壮苗指数。超微结构观测表明：与正常苗相比,徒长苗下胚轴细胞叶绿体长度变长,基粒数及基质片层垛叠增多,淀粉粒消失,嗜锇体小球减少;线粒体增多,且发育较为成熟,内质网有轻微的肿胀。喷施多效唑导致下胚轴细胞叶绿体基质片层松散、肿胀,嗜锇体小球增多、增大;线粒体轻微的肿胀。 2.应用同源克隆和RACE技术从黄瓜茎尖中克隆得到赤霉素合成的关键酶—贝壳杉烯氧化酶(KO)基因cDNA全长序列,命名为CKO, GeneBank登录号为JN792591,其长度为1895bp,开放阅读框(ORF)编码519个氨基酸的蛋白,相对分子量为59.211kD,等电点(PI)为8.45。氨基酸同源性分析发现,CKO与苦瓜的KO氨基酸序列同源性最高,达84%;序列结构分析表明,CKO属于细胞色素超家族P450系,具有细胞色素P450的血红素结构域FXXGXRXCXG和跨膜结构域。实时荧光定量分析表明,CKO在遮光的徒长苗中表达量最高,是正常苗中的5.18倍,在遮阴条件下喷施多效唑可降低该基因的表达。 3.以黄瓜品种‘戴多星’为试材,利用带酶切位点的引物克隆得到该品种基因组中贝壳杉烯氧化酶(CKO)基因的编码区,将该基因插入到植物表达载体pCAMBIA1301-1中,并转化到农杆菌EHA105中。通过叶盘法将CKO介导入烟草叶片中,利用潮霉素对转化植株进行初步筛选,经愈伤、分化后,对潮霉素阳性植株进行进一步的PCR检测和GUS组织化学分析。GUS组织化学分析显示,在转基因烟草的愈伤组织和叶中都表现出GUS活性;PCR检测表明,CKO已经整合到烟草基因组中。研究结果为进一步探讨CKO的生物学功能奠定了基础。