副猪嗜血杆菌4，5血清型的分离鉴定和Neu、Omp2、PaLA、D15基因的序列分析

作     者：李俐睿 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王印

授予年度：2012年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：副猪嗜血杆菌 分离鉴定 毒力基因 克隆分析 

摘      要：副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属成员,被认为是革拉泽氏病（Glaesser’s Disease）的主要病原。在规模化养殖猪场的调查发现,在国内外HPS已经成为严重影响养猪产业的主要病菌。研究表明在与猪繁殖与呼吸综合症病毒等病原混合感染时造成免疫抑制,常常加重感染发病,带来重大经济损失,严重威胁着全世界养猪产业的健康发展。为了解四川省HPS的遗传变异情况,本研究从临床病例中分离鉴到两株HPS,并对其毒力基因进行了克隆分析,为进一步研究HPS的临床防治和建立HPS临床的最新基因突变跟踪以及研究新型高效疫苗奠定了基础。 采用细菌学检测方法和PCR技术对来自四川省遂宁市和眉山市某规模化养猪场疑似HPS感染的发病猪只肺脏等病料进行了分离鉴定,结果分离出2株疑似HPS的细菌,经形态学、染色及培养特性检测、生化试验、血清型试验16S rDNA序列分析,鉴定为HPS,分别名为HPSmeish （眉山株）和HPSsuin（遂宁株）,分别为血清型5型和4型。动物致病性试验显示4型、5型HPS分离株均具有较强致病性,药敏试验表明HPS分离株具有较强的耐药性,HPSsuin仅对阿米卡星、氨苄舒巴坦、复达欣、痢特灵敏感;HPSmeish仅对氨苄舒巴坦、阿莫西林、氟哌酸、氟啶酸敏感。 为了比较HPS4型,5型的（神经氨酸酶）nanh,（外膜蛋白P2）omp2,PaLA,D15的同源性及抗原性,试验设计4对特异性引物,采用PCR扩增HPS的Nue, Omp2, PaLA,D15基因，将其克隆到PMD19-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,通过PCR鉴定,并进行序列测序与分析。结果显示分离株4型与5型的PalA的同源性高达99.1%,核苷酸序列突变很小,只有3处突变位点;两血清型的Nue同源性为98.4%,突变位点很分散;分离株4和5型的D15与参考菌株Huhe0123的同源性都在99%以上。 4型分离株的Omp2序列测定结果表明扩增出1086bp目的片段（含omp2全基因）,与已发表的4型HPS SW124株omp2基因（1077bp）相比,结果显示：4型HPS四川分离株omp2基因相对稳定,核苷酸的同源性为97%,氨基酸的同源性为92.5%,变异区主要集中在110-156,180-202,448-463,580-605这四处碱基序列。 5型分离株的Omp2序列测定结果表明扩增出1098bp目的片段（含omp2全基因）,与已发表的5型HPS Naqasaki omp2基因（1077bp）相比,结果显示：5型HPS四川分离株omp2基因相对稳定,核苷酸的同源性为94.8%,氨基酸的同源性为89.9%。变异区主要集中在380-400,400-425,803-818这三处碱基序列。