药用植物（黄精和黄芪）内生菌的的分离鉴定及胞外多糖结构和生物活性的研究

作     者：宋颖娟 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张厚程;陈敏

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：药用植物内生菌 分离筛选鉴定 胞外多糖 结构 生物活性 

摘      要：药用植物资源因其独特的生物学性质及丰富性,常用于人类和动物疾病的治疗,在医疗卫生保健方面发挥着非常重要的功能。有文献报道,药用植物中的中药多糖在其生物学活性方面发挥着十分显著的作用。从药用植物组织和器官来源的内生菌,它们作为非常丰富的细菌类群,通常与药用宿主植物存在共生或共栖的关系。其能够合成同宿主植物本身相似或相同的一些代谢物。因此,从药用植物中分离纯化内生菌,研究其分泌的胞外多糖与宿主(药用植物)多糖的结构组成和功能差异是本论文研究的重点。黄精多糖和黄芪多糖本身具有独特的生物学特性。本文对黄芪的根和黄精的根状茎进行内生菌分离鉴定,并在此基础上分离纯化出药用植物内生菌中产胞外多糖糖含量高的胞外多糖,并测定其结构性质和生物特性。通过对药用植物的多糖与内生菌的胞外多糖在结构和生物学特性方面的比较,发现内生菌胞外多糖与其宿主植物多糖在结构和单糖组成上具有差异性,但具有许多相似的生物活性。本论文分为三部分内容。第一部分是药用植物黄精和黄芪内生菌的分离、筛选及鉴定(第二章);第二部分是药用植物黄精内生菌B3和黄芪内生菌Z7胞外多糖的分离纯化及性质的研究(第三章);第三部分是药用植物多糖和内生菌胞外多糖生物活性的研究(第四章)。第一部分:首先,采用组织分离法从黄精和黄芪的块根中共分离出17株内生菌,并对内生菌的菌落形态特征进行鉴定。然后对17株药用植物内生菌的生理生化和16S rDNA测序分析。结果显示,黄精内生菌A2、A3为肠杆菌属;黄精内生菌A1、B1、B2、B2为芽孢杆菌属;黄芪内生菌Z1、Z2、Z3、Z4、Z6、M1、M2、M3为芽孢杆菌属;黄芪内生菌Z5和M4为葡萄球菌属;黄芪内生菌Z7为节细菌属。从药用植物中分离到的内生菌大多数为芽孢杆菌属。对其抗菌活性进行测定,结果显示,黄精内生菌B3的发酵处理液对三种指示菌有较弱的抑制作用。黄芪内生菌M1和M2对大肠杆菌有较弱的抑制作用。黄芪内生菌Z1、Z2、Z3、Z5、Z7、M1和M3对枯草芽孢杆菌有较弱的抑制作用,其中黄芪内生菌M1的抑制作用最强。黄芪内生菌Z6、M2和M4对金黄色葡萄球菌有较弱的抑制作用。最后对17株药用植物内生菌产胞外多糖的测定,结果显示,17株内生菌均能够产生胞外多糖,而黄精内生菌B3和黄芪内生菌Z7产生的胞外多糖总糖含量最高。综合以上分析,本实验选择菌株B3和Z7作为后续的研究对象。第二部分:首先,通过除蛋白、脱色和层析对黄精内生菌EPS-B3和黄芪内生菌EPS-Z7分离纯化。然后,通过十八角度及光光散射仪测定多糖的分子量。结果显示,黄精内生菌EPS-B3的分子量为1.863×104Da;黄精多糖(PSP)的分子量为2.791×104Da;黄芪内生菌EPS-Z7的分子量为5.001×104Da;黄芪多糖(APS)的分子量为6.004×105Da。采用离子色谱测定多糖的单糖组分,结果显示,黄精内生菌EPS-B3和黄芪内生菌EPS-Z7主要有Gal、Glc和Man三种单糖组成;黄精多糖主要有Fru、Rha、Gal、Glc、Man和Fru六种单糖组成;黄芪多糖主要的单糖组分包含Fru、Rha、Gal和Glc。黄精内生菌EPS-B3与黄精多糖的单糖组分区别在于Fru、Rha和Fru单糖只存在于黄精多糖中;黄芪内生菌EPS-Z7与黄芪多糖的单糖组分区别在于黄芪多糖中含有Fru和Rha单糖,而黄芪内生菌EPS-Z7中含有Man。同时结合红外光谱分析结果可知,内生菌胞外多糖与其宿主植物多糖在结构和单糖组成上具有差异性,宿主植物多糖可能来源于植物本身产生。第三部分:首先抑菌能力的测定结果显示,分离的药用植物多糖与药用植物内生菌胞外多糖均没有抑菌活性。其次抗氧化的测定结果显示,黄精多糖和黄精内生菌EPS-B3相比其DPPH的清除能力接近,黄芪多糖和黄芪内生菌EPS-Z7相比清除能力也接近。黄精多糖和黄精内生菌EPS-B3相比其超氧阴离子的清除能力接近,黄芪多糖和黄芪内生菌EPS-Z7的清除能力也接近。黄精内生菌EPS-B3的还原能力高于黄精多糖的还原能力,黄芪内生菌EPS-Z7的还原能力高于黄芪多糖的能力。黄精多糖对羟基的清除能力高于黄精内生菌EPS-B3的清除能力,而黄芪多糖与黄芪内生菌EPS-Z7的清除能力相近。最后是体内抗肿瘤的测定结果显示,黄精多糖、黄芪多糖、黄精内生菌EPS-B3和黄芪内生菌EPS-Z7与PBS组相比,抑制肿瘤的活性显著。体外抗肿瘤的结果显示,黄精多糖PSP的体外抗肿瘤活性高于黄精内生菌EPS-B3的体外抗肿瘤活性,而黄芪多糖APS体外抗肿瘤能力低于黄芪内生菌EPS-Z7的体外抗肿瘤能力。抗多糖lgG的抗体滴度测定结果显示,黄精多糖、黄精内生菌EPS-B3、黄芪多糖和黄芪内生菌EPS-Z7能够显著的刺激机体产生相应的抗多糖的lgG的抗体。总之,药用植物