Raf激酶抑制蛋白在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化发生机制中的调控作用

作     者：韦玲 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林兴

授予年度：2015年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：四氯化碳 肝纤维化 RKIP Raf-1/MEK/ERK1,2 

摘      要：肝纤维化是导致多数慢性性肝脏疾病发生及死亡的主要原因。其特征是细胞外基质(ECM)的过度沉积。许多研究证明,肝纤维化是可逆的,然而肝纤维化晚期即肝硬化却是不可逆。因此,阻止或逆转肝纤维化进程成为治疗慢性肝病的重要策略。Raf-1/MEK/ERK1,2通道是一条重要的细胞内信号传导通道,近年来发现Raf-1/MEK/ERK1,2信号通路与肝纤维化的关系密切,可从多方面影响肝纤维化的形成。在肝纤维化及肝硬化进程中,Raf-1/MEK/ERK1,2信号通路处于激活状态,该信号通路的激活可以促进HSCs生长、分化和迁移。Raf激酶抑制蛋白(RKIP),为磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族中的一员,是Raf-1/MEK/ERK1,2信号通路的抑制剂。研究表明,RKIP可以与Raf-1结合,继而阻断下游MEK信号传导;同时,RKIP过表达可竞争性抑制MEK。然而RKIP在肝纤维化形成过程中所起的作用尚未明确。目的本研究将利用CCl4诱导肝纤维化大鼠模型,研究RKIP、p-RKIP、ERK、p-ERK等在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及表达及Raf-1/MEK/ERK1,2通路的活化情况,探讨RKIP在肝纤维化发生机制中的作用。方法采用四氯化碳(CC14)制备大鼠肝纤维化模型。105只SD雄性大鼠,随机分为4组:Ⅰ组60只、Ⅱ组15只、Ⅲ组15只、Ⅳ组15只。Ⅰ和Ⅲ组大鼠灌胃(i.g.)给予50%CCl4花生油溶液2ml/kg,每周2次,共15w;Ⅱ和Ⅳ组大鼠灌胃同体积的生理盐水。每周称重2次,调整CC14给予量。其中,第7w-15w,Ⅲ和Ⅳ组大鼠腹腔注射0.5mg/kglocostatin(RKIP的特异性抑制剂),每周2次。在造模6w、10w、13w、15w时,Ⅰ组分别随机选出部分大鼠,麻醉,取血,取肝脏标本。另外,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组大鼠在15w时,处死,取血和肝脏标本。肝组织切片经HE和Masson三色染色检测病理变化;全自动生化分析仪测定血清谷丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平;免疫组化测定大鼠RKIP,p-RKIP,ERK,p-ERK蛋白的表达;RT-PCR检测RKIP、ERK、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)、mRNA的表达;Western blot和免疫组织化学方法检测RKIP和ERK等在肝组织的表达,同时,用Western blot方法检测RKIP和ERK等的磷酸化水平。结果1.成功复制了CC14诱导的大鼠肝纤维化模型本研究采用灌胃给予SD大鼠50%CCl4油溶液致肝纤维化模型。结果表明,本研究采用灌胃给予SD大鼠50%CCl4油溶液致肝纤维化模型。结果表明,模型对照组大鼠平均体重增长较正常对照组明显减少(p0.05),血清生化检查表明,模型对照组大鼠血清ALT、AST均比正常组大鼠高(p0.01);HE染色和Masson染色表明,模型对照组大鼠肝细胞坏死、变性,肝小叶被破坏,胞浆内出现大量大小不一的脂肪空泡,中央静脉及汇管区周围有大量炎性细胞浸润。以上检测说明该模型符合肝纤维化的病理改变特征,表明造模成功。2.免疫组化检测大鼠肝组织RKIP、ERK及其磷酸化蛋白表达RKIP在正常大鼠肝组织的肝细胞和肝窦周围细胞中均有表达,主要分布在细胞胞浆和胞膜;与正常组比较,随着肝纤维化的发展,模型组大鼠肝脏中RKIPP阳性细胞明显减少(p0.05或p0.01);p-RKIP在正常组大鼠肝组织的肝细胞和肝窦周围细胞中阳性细胞有少量表达,与正常组比较,模型组大鼠肝脏中p-RKIP表达增强(p0.05或p0.01);ERK及p-ERK在正常肝组织中,中央静脉周围、汇管区均有少量表达,模型组大鼠肝组织中可见大量ERK及p-ERK阳性细胞,主要见于汇管区,随着肝纤维化发展,ERK和p-ERK表达具有递增趋势(p0.05或p0.01)。Locostatin干预后,与正常组比较,NS+locostatin组和CCl4+locostatin组大鼠肝组织RKIP表达降低,而p-RKIP、ERK及p-ERK表达升高。与 15w模型组比较,CCl4+locostatin组大鼠肝组RKIP表达降低,而p-RKIP、ERK及p-ERK表达升高。***大鼠肝组织Col-Ⅰ、RKIP、ERK及其磷酸化蛋白表达Western blot分析结果显示,与正常组比较,模型组中大鼠p-RKIP、ERK、p-ERK、Raf-1、p-Raf-1、MEK-1、p-MEK-1、α-SAM、Col-Ⅰ及Col-Ⅲ的相对表达量随着肝纤维化的发展逐渐升高。与正常组比较,第13w、15w时,模型组大鼠肝肝组织中RKIP表达降低(p0.05);Locostatin干预后,与正常组比较,NS+locostatin组中大鼠肝组织RK