P-糖蛋白在健康和大肠杆菌感染肉鸡组织中的表达差异及其对口服恩诺沙星药动学的影响

作     者：郭梦婕 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王丽平

授予年度：2014年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：肉鸡 P-gp Abcb1 免疫组化 real-time RT PCR 高效液相色谱 恩诺沙星 利福平 维拉帕米 药代动力学 大肠杆菌感染 调控 

摘      要：P-gp是由Abcb1基因编码的一种相对分子质量为170 kda的跨膜转运蛋白,属于能量依赖的药物外排泵。近年来的研究发现,P-gp除了在肿瘤细胞中高表达介导其对化疗药物的耐药外,人和动物的正常组织中也有分布,如胆小管、肠上皮、肾小管以及血脑屏障等,可限制药物及其它外源性物质在生物体内的吸收、分布和排泄,是影响口服药物生物利用度的一个重要因素。P-gp的表达可以受到多种因素影响,包括化学物质、年龄、性别、生理状态、疾病以及激素等。目前关于大肠杆菌感染对肉鸡体内P-gp表达和功能的影响以及对口服底物药物药动学过程的研究仍较少,故本试验研究了大肠杆菌感染对肉鸡P-gp mRNA表达的影响及其对恩诺沙星在肉鸡体内药动学的影响,并初步探讨了大肠杆菌对P-gp mRNA表达影响的调控机制。首先,采用P-gp诱导剂利福平以及抑制剂维拉帕米研究其对恩诺沙星在肉鸡体内药动学的影响,证实恩诺沙星为P-gp的底物。本研究选取30只健康8周龄肉鸡,随机分为6组(n=5),分别为单剂量口服恩诺沙星(10 mg/***)组、单剂量口服维拉帕米(15 mg/***)后口服恩诺沙星(10mg/***)组、单剂量口服利福平(500mg/只)后口服恩诺沙星(10 mg/***)组、单剂量静注恩诺沙星(10 mg/***)组、单剂量口服维拉帕米后静注恩诺沙星(10 mg/***)组以及单剂量口服利福平(500mg/只)后静注恩诺沙星(10mg/***)组。给药后在不同时间点采血,采用HPLC法测定血浆中恩诺沙星的药物浓度。结果显示：恩诺沙星的吸收速率常数Ka为1.38+0.31 h-1,达峰时间Tmax为1.78±0.18 h,血浆中峰浓度Cmax为1.97±0.24μg/mL,药时曲线下面积AUCo-∞为14.54+1.03(fg/mL)* h。给予P-gp抑制剂维拉帕米后,口服恩诺沙星的峰浓度Cmax上升为23±0.37μg/mL (P=0.459),药时曲线下面积AUCo-。。极显著上升为24.63±1.85(μg/mL)*h(P=0.004),达峰时间Tmax显著提前为1.11±0.14 h(P=0.026),吸收速率Ka极显著上升为2.98±0.29 H1(P=0.008),生物利用度增加了1.62倍,但维拉帕米对静脉注射恩诺沙星的药动学参数影响并不显著;给予P-gp诱导剂利福平后,口服恩诺沙星的峰浓度Cmax极显著下降为0.45±0.06μg/mL(P=0.002),达峰时间Tmax延迟至5.32±1.15 h(P=0.011),药时曲线下面积AUCo-∞显著降低为8.37±2.36 (μg/mL)*h (P=0.036),吸收速率Ka显著降低为0.38±0.1 h-1(P=0.029),生物利用度下降1.64倍,同样其对静脉注射的恩诺沙星药动学参数并未产生显著影响。结果表明P-gp活性被调节后对肉鸡体内恩诺沙星的口服吸收过程会产生显著影响,证实恩诺沙星为P-gp底物。基于上述实验结果,本论文进一步研究了大肠杆菌感染对肉鸡组织中P-gp的功能和表达的影响。实验选取10只4周龄健康肉鸡,随机分为健康组和大肠杆菌感染组。处死后,采集肝脏、’肾脏、十二指肠、空肠和回肠置于液氮中,后转入-80℃冰箱保存。提取总RNA,反转后,对Abcb1进行相对定量测定。结果显示,与健康组相比,大肠杆菌感染之后Abcb1的表达量在各组织中都有所上调,其中在肾脏、空肠和回肠中差异显著(P=0.032, P=0.017, P=0.046).然后,我们采用免疫组化的方法,探究P-gp在健康和大肠杆菌感染肉鸡肝脏、肾脏、十二指肠、空肠和回肠的分布特点及表达差异。结果显示,P-gp在肝脏主要定位于肝细胞之间的胆小管膜上,在肾脏主要定位于肾小管的细胞膜上,在小肠主要定位于小肠绒毛上皮细胞顶端。采用Imagepro-plus软件进行半定量分析,比较P-gp在健康组和感染组表达量的差异。结果显示,感染之后P-gp在肝脏和肾脏细胞内的定位量有所上升,但是在细胞膜上的定位减少。P-gp在十二指肠中的表达量几乎没有变化,在空肠和回肠中表达量显著上升(P0.05)。最后,我们使用HPLC检测了大肠杆菌感染前后恩诺沙星血药浓度的变化情况,同时检测P-gp抑制剂维拉帕米对鸡口服恩诺沙星的药动学影响。我们选用40只4周龄健康肉鸡,随机分为4组：(1)口服恩诺沙星健康组(2)口服恩诺沙星+维拉帕米(3)口服恩诺沙星感染组(4)口服恩诺沙星+维拉帕米感染组。结果表明,与健康组肉鸡相比,感染会造成恩诺沙星的Cmax(P=0.000) 和 AUC0-12h (P=0.042)极显著或显著下降,Tmax显著延长(P=0.040),T1/2a和T1/2e显著升高(P=0.045,P=0