RNAi Cyclin E对肝癌HepG2细胞生长及细胞周期的影响

作     者：贾海全 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵国强;赵明耀

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：周期蛋白E 肝癌 HepG2 细胞周期 细胞增殖 

摘      要：背景与目的 细胞周期调控机制紊乱导致的细胞生长失控被认为是肿瘤发生的重要机制之一。cyclin E是周期蛋白的一种,它能够与CDK2一起促进细胞周期的G1／S转换。研究发现异常情况下,由于cyclin E无顺序无规律的过度表达,cyclin E可持续存在于整个细胞周期中,不断激活CDK2和磷酸化pRb,驱使细胞超越控制机制发生异常增殖,引起肿瘤的发生。此外,cyclin E在细胞内的积累也会导致染色体的不稳定性(chromosome instability, CIN),最终引起肿瘤的发生。研究表明cyclin E的过表达同中心体的高增殖密切相关,提示cyclin E持续的过表达可引起中心体的异常增殖,扰乱有丝分裂,从而导致早期癌变的发生。 研究表明,cyclin E与肝癌的发生可能相关。肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,我国是肝癌的高发区,每年发病人数超过全世界肝癌死亡人数的50%,是中国第2位的肿瘤死亡原因。临床实验和动物实验均表明,肝癌患者癌组织中的cyclin E表达增加,而且研究也发现cyclin E的表达与肝癌的分化程度、侵袭性和临床分级可能相关。 综合cyclin E对细胞周期的调控特点和cyclin E与肝癌之间的关系,笔者利用RNA干扰技术,通过构建转染针对cyclin E的siRNA载体,降低肝癌HepG2细胞中cyclin E的表达水平,观测降低肝癌组织中cyclin E的表达水平对肝癌细胞生长及细胞周期的影响。 方法 根据siRNA目标序列的选取原则,设计并合成2对cyclin E基因靶向siRNA序列的DNA单链,退火成双链发卡样DNA;将其重组入siRNA载体pGFP-V-RS;得到重组子pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siCE1122;对重组子的插入序列进行DNA序列测定,并与设计序列做同源性比较。利用脂质体LipofectAmineTM2000包裹,将pGFP-V-RS-siCE951、pGFP-V-RS-siCE1122和pGFP-V-Con分别转入人肝癌HepG2细胞中,同时设空白对照组(不转染任何质粒仅加转染试剂)。RT-PCR和Western-Blot方法检测各组细胞HepG2mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术检测各组肝癌细胞的细胞周期,CCK-8试剂检测细胞的增殖,软琼脂克隆形成检测胞克隆形成能力。 结果 1.经过同源性检索和优选确定951-969位(GCAAAAGG TTTCAGGGTAT)、1122-1140位(GGACAAAGCCCGAGCAAAG)为siRNA靶序列。 2.筛选得到重组子pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siCE1122,测序分析其插入序列与设计完全一致。 3.干扰1组(转染pGFP-V-RS-siCE951)和干扰2组(转染pGFP-V-RS-siCE1122)细胞cyclin E mRNA的相对表达量分别为0.215±0.021和0.178±0.019,显著低于空白对照组和无关siRNA对照组(分别为0.406±0.037和0.372±0.042,p0.05)。 4.空白对照组、无关siRNA对照组、干扰1组和干扰2组细胞在大约54KD处均有免疫印迹出现,其中空白对照组和无关siRNA对照组的免疫印迹显著强于干扰1组和干扰2组。 5.细胞增殖实验显示,干扰1组和干扰2组与空白对照组和无关siRNA对照组比较,在3d、4d、5d细胞孔内的吸光度值显著减少,差异有显著性(p0.05),;干扰1组和干扰2组的各期细胞比例与空白对照组和无关siRNA对照组比较,S和G2/M期细胞比例减少,GO/G1期细胞比例增加,有显著性差异(p0.05)。 结论 1. cyclin E951-969位(GCAAAAGGTTTCAGGGTAT)、1122-1140位(GGACAAAGCCCGAGCAAAG)为靶区段,构建的siRNA载体pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siC