CDK2-AP1改变与微卫星不稳定结直肠癌发生关系的研究

作     者：钱昕 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：来茂德

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：结直肠癌 微卫星不稳定性 细胞周期素依赖激酶2-相关蛋白1 差异表达 

摘      要：我国是世界上新发癌症患者最多的国家,恶性肿瘤是主要死因之一,估计每年约有130万人死于恶性肿瘤。而结直肠癌居肿瘤发病和癌症死因第三、四位,而且呈现发病率不断攀升和发病低龄化的特点。近二十年来,随着我国居民生活方式和饮食结构的改变,结直肠癌的发病率和死亡率呈现上升的趋势。因此对结直肠癌（colorectal cancer, CRC）发病机制以及防治策略进行研究有十分重要的意义。 微卫星序列是广泛存在于原核及真核生物基因组中具有高度多态性的短的串联重复核苷酸序列,由1～6个核苷酸组成,重复次数可达10～50次。微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI）是指DNA复制时,由于复制错误且不能被错配修复酶更正而引起的简单重复序列的改变。就肿瘤而言,指的是与正常组织相比,在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变,出现新的微卫星等位基因现象。MSI现象最早在结直肠癌中发现,目前为止,CRC也是MSI研究最多的一种疾病。 细胞周期素依赖激酶2-相关蛋白1（cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1,CDK2-AP1）是个定位于12q24的高度保守的基因,通过抑制细胞周期素依赖激酶2的活性发挥其生长抑制因子的作用。CDK2-AP1以杂合性丢失和其翻译产物表达减少为特点,在正常组织中持续表达并且与多种细胞生长调节因素相关。该基因的表达缺失见诸多种人类肿瘤,并且与肿瘤的浸润、转移、预后不良相关。 Yuan等通过cDNA芯片发现,高频微卫星不稳定（high-frequency MSI,MSI-H）结肠癌细胞系CDK2-AP1表达较微卫星稳定（microsatellite stable, MSS）细胞系下降,并且出现增殖活性增高、凋亡减少等生物学行为改变。MSI-H结肠癌细胞系转染CDK2-AP1后,上述表型可以得到逆转。进一步研究发现,CDK2-AP1基因3’-UTR区一个新的微卫星位点（T）8改变见于21%（3/14）MSI-H结肠癌细胞系及13%（4/31）的MSI结直肠癌肿瘤组织中,与CDK2-AP1基因表达下调相关。CDK2-AP1基因（T）8位点很可能是一个MSI-H结直肠肿瘤相关的新的重要单核苷酸微卫星位点。 本实验的目的是通过检测（?）JCDK2-AP1基因微卫星（T）8位点突变在中国浙江汉族人群结直肠癌患者中的分布情况,明确该位点的改变对CDK2-AP1基因表达的影响。通过研究,我们旨在建立恶性肿瘤MSI及基因突变检测平台,为构建中国人特异性基因突变谱、研发中国汉族人特异性基因治疗策略及预后评估等奠定基因组基础。 在实验过程中,我们首先对传统的DNA酚-氯仿抽提法进行了改进,成功从福尔马林固定后的结直肠癌患者的肿瘤和正常组织中分别抽提得到能够满足继续实验要求的DNA样本,建立实验室结直肠癌患者组织库。 在下一步的MSI-H结直肠癌患者的筛选过程中,我们引入具有高通量及高敏感性的多重荧光PCR-毛细管电泳法（flurescent multiplex polymerase chain reaction-capillary electrophoresis, FM-CE）检测国际癌症会议推荐的BAT25、BAT26. D2S123.D5S346和D17S250共5个微卫星位点在总共506例结直肠癌肿瘤组织中的微卫星状态,获取MSI-H结直肠癌（有2个或2个以上位点存在微卫星不稳定现象）样本共73例,约占总检测样本的14.43%,与文献报道的频率相符。 同时我们通过荧光定量PCR的方法检测了CDK2-AP1在结直肠癌细胞系RKO （MSI-H）和SW480 （MSS）中的表达情况,发现该基因在RKO细胞系中的表达较SW480细胞系显著下调（P0.05）。 此外,我们还通过荧光定量PCR的方法检测了CDK2-AP1在7例MSI-H结直肠癌患者和10例MSI-L/MSS结直肠癌患者组织中的表达情况,但并未发现两者间的表达存在显著的差异。 我们根据CDK2-AP1基因微卫星（T）8位点的序列设计单标的荧光引物,同样采用荧光PCR-毛细管电泳法检测73例MSI-H结直肠癌组织及60例MSS/MSI-L （low-frequency MSI,MSI-L）结直肠癌组织中（T）8位点的突变情况,但是在检测的133例组织中并未发现（T）8位点缺T突变的存在。而对其中20例组织的重复测序验证也发现与荧光PCR-毛细管电泳法相同的结果。我们通过测序的方法检测了包括RKO（MSI）、CW2（MSI）、Lovo （MSI）、SW480（MSS）、SW620（MSS）、HT29（MSS）和CaCo2