基于Keap1-Nrf2通路的蛋清源抗氧化小肽筛选及其作用机制研究

作     者：李良煜 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘静波

授予年度：2017年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：蛋清源小肽 Keap1-Nrf2通路 筛选 作用机制 

摘      要：抗氧化肽作为一种重要的抗氧化剂,具有安全、活性好、易吸收等优点,已成为研究的热点。但在目前的抗氧化肽的研究之中,仍存在着如其分子水平作用机制研究不足等一些问题有待解决。在本文中,我们以优质的食物蛋白——蛋清蛋白作为抗氧化肽的蛋白来源,以可被完整吸收,活性最不易受机体吸收影响的小肽(小肽即二肽和三肽的总和)作为试验的研究目标。结合与细胞自身抗氧化相关的重要通路Keap1-Nrf2通路,从蛋清源小肽中筛选具有抗氧化作用的蛋清源小肽并研究其对Keap1-Nrf2相互作用的影响,明确小肽基于Keap1-Nrf2通路的抗氧化作用,从分子水平上阐明小肽抗氧化作用机制,为抗氧化肽的研究和应用奠定基础。本论文主要结论如下:(1)基于分子对接技术初次筛选能直接抑制Keap1-Nrf2相互作用的蛋清源小肽。首先建立并优化了由8400条小肽组成的蛋清源扩展小肽库,接着以小肽库为配体,从PDB数据库中选择并优化2FLU文件中的Keap1的Kelch区域为受体,以PDB文件2FLU自带配体所形成的结合位点为基础,设计了3个新的结合位点:位点1(中心坐标为x:-4,y:6,z:0,半径:21?),位点2(中心坐标为x:5,y:9,z:1,半径:15?)和位点3(中心坐标为x:7.36,y:8.33,z:1.77,半径:15?)。使用Discovery Studio软件的CDOCKER程序在这3个结合位点上分别进行分子对接,最终筛选出抑制Keap1-Nrf2相互作用能力最强的20条小肽:二肽EK、DK、WE、DW、EY、EW与三肽DKE、QKE、DKD、EDW、DWE、DKK、EEW、EWE、ECD、DET、DEW、DWD、DDW和DKQ。(2)基于荧光偏振技术再次筛选能直接抑制Keap1-Nrf2相互作用的蛋清源小肽并分析其作用机制。首先通过查阅相关文献和对本试验体系进行分析比较,建立了小肽荧光偏振试验方法。并用该方法对这20条小肽进行了荧光偏振试验,从20条小肽中筛选出了小肽DKK和DDW,这两个在非细胞环境中干扰Keap1-Nrf2相互作用的能力最强的小肽。接着对试验结果进行分析,得到这两条小肽在分子水平上具有干扰Keap1-Nrf2相互作用的可能作用机制:即这两条小肽均能与影响含ETGE序列的Nrf2肽与Keap1蛋白Kelch区结合的关键氨基酸残基形成氢键。并得到一个结论:Arg380和Asn382很可能是Keap1蛋白上对Keap1-Nrf2相互作用影响最大的氨基酸残基。除此之外,结合分子对接试验对小肽荧光偏振试验进行分析,发现在分子对接试验中,设计多位点进行分子对接试验是有意义的,同时得到一个可能的结论:在分子对接试验中,设计多个新结合位点来进行分子对接试验这一方法,有可能消减由受体文件自带的配体分子与试验配体分子大小存在明显差异带来的对试验结果的不利影响,从而提高试验结果的准确性。(3)基于细胞试验研究蛋清源小肽DKK与DDW在细胞环境下抑制Keap1-Nrf2相互作用的能力并分析其作用机理。首先构建了H2O2诱导的Hep G2细胞氧化损伤模型。并对荧光偏振试验筛选出的小肽DKK和DDW进行了细胞毒性试验,确定了后续试验中,小肽DKK与DDW的工作浓度。接着通过小肽DKK与DDW对H2O2损伤Hep G2细胞的作用试验,发现小肽DKK和DDW能提高H2O2损伤Hep G2细胞的抗氧化能力。然后通过小肽DKK与DDW对H2O2损伤Hep G2细胞的CAT与SOD试验,发现小肽DKK与DDW处理下H2O2损伤Hep G2细胞其CAT和SOD活力上调。综合上述细胞试验结果,明确了小肽DKK和DDW在细胞环境中具有抑制Keap1-Nrf2相互作用的能力。最终通过分析得到了小肽DKK与DDW提高H2O2损伤细胞CAT、SOD活力的作用机制:小肽DKK与DDW进入到H2O2损伤Hep G2细胞的细胞质中,占据了Nrf2与Keap1的结合位点,导致细胞质中的Nrf2转移到细胞核中,与Maf形成异源二聚体后,结合ARE,促使ARE所调控的CAT和SOD基因的表达,最终导致CAT、SOD活力上升。综上所述,通过上述试验从蛋清源小肽中筛选出了能干扰Keap1-Nrf2相互作用从而在细胞内发挥抗氧化作用的小肽DKK与DDW,并得到了其在细胞和分子水平的作用机制,为抗氧化肽的研究和应用奠定基础。