IL-6对c-kit+心脏干细胞的影响及其机制的研究

作     者：薛津 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：段亚琦

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：IL-6 心脏干细胞 增殖 迁移 分化 

摘      要：一、背景心脏干细胞(Cardiac stem cells,CSCs)是心脏内具有增殖和分化能力的细胞,可分化为心脏细胞的三种谱系即心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。如何促进CSCs迁移并分化为心肌组织一直是再生医学研究领域的热点之一。目前已有研究发现心梗后梗死周边区大量炎症因子聚集,其中基质细胞衍生因-1(Stromal cell-derived factor 1,SDF-1)和干细胞因子(Stem cell factor,SCF)能促进CSCs迁移至梗死区域;IL-6可以促进内源性心肌再生。IL-6促心肌细胞再生的作用是否与其对心脏干细胞的影响及调控有关,目前尚无报道。因此本课题拟研究炎症因子IL-6对CSCs增殖、分化及迁移的影响。二、目的通过CCK-8细胞增殖assay、免疫组化以及transwell等方法分别研究IL-6对c-kitCSCs增殖、分化以及迁移的影响,并阐明其机制,为进一步完善c-kitCSCs在临床治疗心梗和心衰等疾病提供理论基础。二、方法1.通过免疫组化追踪Brd U细胞和CCK-8增殖assay等方法研究IL-6对c-kitCSCs增殖的影响。2.IL-6干预c-kitCSCs后,通过Western Blot方法研究IL-6影响c-kitCSCs的可能信号通路。3.通过免疫组化技术和real time RT-PCR等方法研究IL-6对c-kitCSCs分化的影响。4.加入信号转导通路特异性抑制剂,抑制AKT、ERK和STAT3的磷酸化,重复CCK-8增殖assay以及免疫组化实验,观察IL-6影响c-kitCSCs增殖及分化的可能机制。5.通过transwell研究IL-6对c-kitCSCs迁移的影响。三、结果1.IL-6对c-kitCSCs增殖的影响:IL-6(10、50、和100 ng/ml)促进c-kitCSCs增殖能力,具有统计学意义,但无明显的浓度依赖性;10 ng/ml和50 ng/ml IL-6不同程度地促进STAT3、ERK和AKT的磷酸化,100 ng/ml IL-6不改变这三种蛋白质的磷酸化水平;溶解通路抑制剂的DMSO(0.1%)对细胞增殖无明显影响,10 ng/ml IL-6的促增殖效应能被STAT3抑制剂STA21、ERK抑制剂FR180204或AKT抑制剂AZD-8835抑制(DMSO+STA21/FR180204/AZD-8835+IL-6组&DMSO+IL-6组)。2.IL-6对c-kitCSCs向心肌分化的影响:无IL-6干预,第一周时未观察到CSCs自发心肌分化,第二周与第四周仅有少量自发分化;不同浓度IL-6(10、50、和100 ng/ml)干预1、2、4周,仅IL-6 10 ng/ml组诱导c-kitCSCs分化为Troponin I阳性细胞比率明显高于同时期对照组;DMSO对心肌分化无明显影响,10 ng/ml IL-6的促c-kitCSCs向心肌分化效应能被三种通路小分子抑制剂抑制(DMSO+STA21/FR180204/AZD-8835+IL-6组&DMSO+IL-6组);10 ng/ml IL-6干预c-kitCSCs 1或2周后,反应心肌细胞成熟的离子通道亚型Cav1.2和Kir2.1的表达量与空白对照组相比均下降。3.IL-6对c-kitCSCs向平滑肌分化的影响:无IL-6干预,1周、2周和4周的CSCs能自发分化出一定比例的平滑肌细胞;加入不同浓度IL-6(10、50、和100ng/ml)干预后,c-kitCSCs两周内分化的α-SMA阳性细胞比率均高于同时期对照组;分化第四周与同时期对照组相比仅10 ng/ml IL-6继续增加α-SMA阳性细胞比率,其他浓度IL-6组不影响阳性细胞率(50ng/ml)甚至降低阳性细胞率(100ng/ml);然而DMSO基础上的IL-6并没有显示促平滑肌分化作用,c-kitCSCs向平滑肌分化效应依然能被AKT和STAT3两种通路小分子抑制剂部分抑制(DMSO+STA21/AZD-8835+IL-6组&DMSO+IL-6组/DMSO组/空白对照组)。4.IL-6对c-kitCSCs迁移的影响:加入不同浓度IL-6(10、50、和100 ng/ml)干预后,c-kitCSCs迁移能力随着IL-6浓度的增高而增强。四、结论IL-6影响c-kitCSCs的增殖、分化和迁移能力:低浓度10 ng/ml IL-6可以稳定地促进c-kitCSCs的增殖、分化和迁移能力,但同时抑制心肌细胞的成熟;高浓度长时间100 ng/ml IL-6抑制c-kitCSCs的分化。其促增殖和分化的信号通路与JAK/STAT、RAS/ERK和PI3K/AKT三种途径有关。这为提高使用c-kitCSCs治疗心衰成功率的潜在目标提供了新的理论基础。