ITS基因关联鉴定分析灵芝三萜酸高产菌株

作     者：莫秀芬 

作者单位：武汉理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：楼一层

授予年度：2017年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：DNA条形码 灵芝三萜酸 响应面分析 

摘      要：灵芝是我国的传统中药,它的药用价值得到了全球的认可。随着中药分子生物学技术的发展,灵芝基因组图谱得以精细绘制,推荐灵芝成为药用模式真菌。灵芝三萜化合物有着广泛药理作用,成为了现代中药开发研究的源泉之一。由于灵芝三萜来源问题导致产量参差不齐,灵芝三萜高产菌株的筛选有待更多的研究。以传统中药理论为基础,结合最新的中药鉴定分析技术、现代化工艺生产技术,对灵芝三萜酸高产菌株进行深入研究,对菌株筛选和应用有重要意义。本文主要研究了灵芝菌株的培养、DNA条形码的提取、ITS序列扩增以及灵芝的鉴定分析。确定了供试菌株的种类为Ganoderma lucidum、Ganoderma sinense和Ganoderma applanatum。得到了赤芝(Ganoderma lucidum)、紫芝(Ganoderma sinense)、扁芝(Ganoderma applanatum)三种菌株的主导单倍型,这三种菌株的ITS序列长度分别为542 bp,544 bp,548 bp。实验表明灵芝ITS序列有很好的鉴定作用。针对灵芝三萜酸的提取,以适合药企实际生产为基础,引入了比较具有创新性的响应曲面法,通过建立数学模型对该提取方法的过程进行优化研究。实验表明以无水乙醇作为提取溶剂,采用回流法能提高灵芝三萜酸的提取率。通过模型分析和实际操作,最终得到的工艺参数为:提取时间2 h,液料比11:1,提取次数3次。在对灵芝单倍体研究的实验中,确定了0.6M甘露醇、1.5%酶解液在37℃进行两小时反应作为分离方法。通过进行单核苷酸多态性检测,确定了灵芝的单倍体结构。该方法操作简单、稳定性强,为后续研究提供了很好的实验基础。