海参养殖池微生物多样性及其动态研究

作     者：缪栋 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：包卫洋

授予年度：2017年

学科分类：090801[农学-水产养殖] 0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：海参养殖池 流式细胞仪 细菌 古菌 真核微生物 高通量测序 CCA qPCR ITS rDNA 

摘      要：海参养殖业是我国特色海水养殖产业之一,主要分布在辽宁和山东沿海。海参养殖业发展迅速,2010年全国海参养殖面积已达到万公顷,产量达万吨,产值接近亿元。然而,相对于其迅速发展的规模,与海参养殖技术相关的基础研究还比较滞后。因此,相关基础研究越来越受到人们的重视。海参养殖环境中微生物有着十分重要的地位,大部分微生物以生产者或分解者作用参与水生生态系统,部分寄生或共生型病原微生物会造成海参疾病爆发,与海参的健康生长有着十分紧密的联系。而在人工养殖过程中,不规范的投放饵料、药物滥用等造成池底物质堆积,往往会导致水体微生态平衡受到严重破坏,水质恶化、缺氧等,造成海参免疫力下降或死亡;另外,水体富营养化也会造成水体优势青苔与养殖生物饵料藻类竞争,造成底质腐败等,进而给海参养殖造成直接或间接的负面影响。因此,海参养殖环境的健康状况与微生物群落的丰度、群落结构有着紧密的联系,探究养殖环境中微生物群落的组成与动态变化对于海参养殖业具有重要的理论和实践意义。基于以上背景,本工作对海参养殖池塘中的微生物多样性和年度动态变化进行了研究,采用流式细胞术检测水体中浮游微生物丰度;通过高通量测序检测真菌、古菌、细菌等不同类型的微生物多样性及其丰度变化;利用连续流动分析仪对海参养殖水体的环境因子进行测定;综合群落结构和环境因子寻找影响微生物群落变化的制约性因素。另外,针对青苔爆发频繁的实际性问题,利用特异性引物设计和定量PCR技术相结合,探讨检测海参养殖池中青苔孢子的分子检测方法,以期达到对青苔爆发的早期预警。本研究旨在为海参养殖池塘环境微生物生态调控模式的建立提供一定的基础资料。主要研究结果如下:1海参养殖池浮游微生物的分布利用流式细胞仪技术研究了海参养殖池塘水体环境浮游微生物丰度变化及其与环境因子的关系。结果表明:(1)浮游微生物检测出聚球藻、皮微级浮游植物、纳微级浮游植物、隐藻、高低核酸异养细菌几大类型,其中细菌数量级非常大,几乎达到106/mL,而浮游植物的数量级较小,只有102/mL～103/mL。(2)浮游微生物一般都是3月开始生长,到6月份处于爆发顶峰期,9月份的时候已经处于衰退期。(3)浮游微生物数量与环境中的溶解氧,盐度、pH、可溶性总氮具有一定的相关关系,其中,溶解氧和pH对于浮游微生物的影响是最大的。2海参养殖池微生物多样性分析水样过滤膜提取DNA,并进行高通量测序,再结合环境因子对比,研究海参养殖池微生物多样性。结果表明:(1)细菌中变形菌门是重要组成部分,其中α-变形菌(Alphaproteobacteria)是主要类群。CCA分析结果显示,原核生物类群受pH、亚硝态氮、硅、氨态氮、温度控制。(2)古菌生物中,大部分样品优势类群是DHVEG-6。而且大部分古菌如DHVEG6、MHVG、GroupC3、MBGB等都与各种形态可溶性氮元素有着显着甚至是极显著相关性。CCA分析的结果显示出微生物群落受盐度和硅控制。(3)真核微生物中泛植物界占据主要组成部分,而在泛植物界中绿藻门是最主要的。CCA结果显示生物类群受盐度、温度、pH、溶解氧、亚硝态氮、氮磷比控制影响。3海参养殖池三种藻类孢子/配子qPCR检测对海参养殖池三种爆发性青苔进行了 18S和ITS区间测序,设计了以核糖体转录间隔区(ITS)为靶区域的种类特异性PCR引物,通过藻类和环境水样DNA对照实验检验其特异性和适用性。结果如下:(1)所得三种藻类ITS引物均具有一定种类或类群特异性。(2)三对引物在qPCR方法中呈现一定的灵敏度,三株藻类最低检出限度:缘管石莼约1.66×10-4 ng/μL,200个ITS基因拷贝数;未能鉴定到种约6.6×10-6ng/μL,200个ITS基因拷贝数;萱藻1.66×104ng/μL,400个ITS基因拷贝数。(3)使用qPCR方法对烟台海参养殖水体6个季度环境水样中的萱藻孢子/配子进行定量检测,发现样品中萱藻孢子/配子ITS拷贝数的季节变化与青苔爆发规律呈现较高的吻合度,萱藻爆发前期伴随水体中孢子/配子量的增高,初步显示藻类爆发可被qPCR方法预测。