播娘蒿胰蛋白酶抑制剂基因转化油菜的研究

作     者：杜文明 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：管荣展

授予年度：2007年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：播娘蒿 胰蛋白酶抑制剂 转基因 油菜 抗虫 

摘      要：植物蛋白酶抑制剂基因具有广谱抗虫性、安全、无毒副作用等优点,研究蛋白酶抑制剂基因具有重要意义。本研究利用农杆菌介导法将2个播娘蒿胰蛋白酶抑制剂(DsTI)基因导入甘蓝型油菜中,研究其功能,主要结果如下: 构建植物表达载体pCAMB11301-DsTI1和pCAMBI1301-DsTI2,经酶切验证后,转入农杆菌菌株LBA4404中。建立了甘蓝型油菜品系NJ5424子叶节的遗传转化体系,将油菜子叶节在附加4mg/L 6-BA的培养上进行预培养,在含有3.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA和12.5mg/L潮霉素(Hyg)的选择培养中筛选。再生芽在含有2.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA和12.5mg/L Hyg的培养基中进行分化培养。DsTI1和DsTI2转化甘蓝型油菜品系NJ5424共获得41株潮霉素抗性植株,经过PCR鉴定共计获得17株阳性植株。 对2个基因的T代转基因油菜进行PCR检测,结果表明T代转基因油菜植株呈现3:1分离,表明目的基因以单拷贝插入油菜基因组中,并且能够在转基因油菜后代中稳定遗传。RT-PCR实验表明外源基因DsTI1、DsTI2在转基因油菜中可正常表达。酶活性测定结果表明,DsTI1和DsTI2转基因油菜对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制能力远高于野生型,说明播娘蒿胰蛋白酶抑制剂基因具有丝氨酸蛋白酶抑制剂功能。 室内抗虫性实验表明,喂食转基因油菜叶片的菜青虫幼虫的生长发育缓慢,死亡率升高;转基因油菜具有抗虫性。田间虫害调查结果显示虫害级别低于野生型,但差异不显著,这可能与今年虫害情况有关。 T代农艺性状抽样调查结果表明,DsTI1和DsTI2转基因油菜植株与野生型植株多数性状不存在显著差异,仅有部分性状存在显著差异。例如,在DsTI1-2家系中,存在差异的性状是结果密度;在DsTI1-4家系中,转基因油菜与野生型植株的每果粒数存在差异。