拟南芥根中ARF7，ARF19调控PHR1的分子机制研究

作     者：马光婧 

作者单位：华中师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：任峰

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：拟南芥 ARF7 ARF19 PHR1 低磷胁迫 生长素 

摘      要：PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 1(PHR1)是拟南芥低磷胁迫应答重要的调控因子,但PHR1在低磷胁迫应答中的转录调控机制尚不清楚。生长素作为植物生长发育的重要激素,在拟南芥低磷胁迫应答中也发挥重要作用。本论文研究将拟南芥低磷应答中生长素信号与PHR1直接联系起来,发现PHR1基因是生长素应答因子ARF7和ARF19的直接靶基因,并且在拟南芥根中受生长素信号正调控。论文获得的主要研究结果如下:***1基因受低磷和生长素诱导利用PHR1p:GUS转基因拟南芥进行启动子活性分析。GUS染色反应显示在高磷条件下PHR1在拟南芥根中有较高水平的表达;在低磷条件下PHR1表达有一定程度的提高。qRT-PCR分析也得到相同的结果。外源生长素NAA和IAA处理后发现,无论在高磷或低磷条件下,PHHR1在拟南芥根中的表达均显著提高。而外源生长素极性运输抑制剂NPA和TIBA处理后,根中PHR1表达明显降低。这些结果说明在拟南芥根中PHR1在转录水平受到生长素调控。***1启动子生长素应答元件分析用生物信息学方法分析PHR1启动子中的顺式作用元件,发现PHR1启动子中有三个生长素应答元件,包括一个AuxRE(GAGACA)和两个TGA-element元件(AACGAC)。分别对这三个生长素应答元件进行单缺失突变,双缺失突变和三缺失突变,然后分析不同缺失突变启动子活性。实验结果发现三个生长素元件均是PHR1转录所必须的,其中TGA-1 element元件是最重要的。*** 和ARF19受低磷诱导qRT-PCR分析表明在拟南芥根中ARF7和ARF19基因受低磷诱导。ARF7p:GUS和ARF19p:GUS转基因拟南芥GUS活性分析也显示低磷条件下转基因拟南芥根中GUS活性显著增强,这些结果说明ARF7和ARF19的表达模式与PHR1相似。***7和ARF19能与PHR1启动子结合酵母单杂交实验表明在酵母细胞中ARF7和ARF19能与PHR1的启动子结合并启动报告基因表达。体外凝胶迁移实验(EMSA)和体内染色质免疫共沉淀实验(ChIP)也证明了 ARF7和ARF19均可以与PHR1启动子上三个生长素应答元件结合。这些研究结果第一次证明了 ARF家族调控因子可以与TGA-element顺式元件直接结合。***7和ARF19正调控PHR1基因在arf7、arf19、ar7arf19突变体中PHR1及下游磷饥饿诱导基因(PSI基因)表达均明显下调。此外,arf7arf19双突变体中出现磷摄入量减少和地上部分花青素积累增多的表型。将PHR1p:GUS载体转化arf7,arf19和arf7arf19突变体,GUS染色活性分析发现,其GUS活性呈现不同程度的下降。这些实验结果说明在拟南芥体根中PHR1基因受到ARF7和ARF19的正调控。***-CC家族其它成员基因受ARF7和ARF19调控在拟南芥中MYB-CC家族包含15个成员,除PHR1外,其它成员基因的启动子中也有生长素应答元件。ChIP分析显示ARJF7和ARF19还可以与这些基因(At5g29000/PHL1,At5g06800,At3g13040,At3g12730,At4g13640/PHL3,At1g69580,At3g04030)启动子生长素应答元件结合。这些结果说明ARF7和ARF19转录因子可能是MYB-CC家族基因上游调控因子。7.低磷条件下PHR1对拟南芥侧根的调控不依赖于LBD16和LBD29ARF7和ARF19通过直接调控下游靶基因LBD16和LBD29来调控拟南芥侧根起始和发育。低磷条件下,phr1突变体表现为侧根减少,而PHR1过量表达转基因拟南芥表现为侧根增多。qRT-PCR分析显示phr1突变体和PHR1过量表达转基因拟南芥根中,LBD16和LBD29的表达并没有发生显著性改变,说明低磷条件下PHR1对侧根的影响并不依赖于LBD16和LBD29。综合上述实验结果,本论文揭示了拟南芥根中生长素信号和PHR1转录因子协同应答低磷胁迫的分子调控新机制。