表达ZJ-1株新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的筛选及其免疫效力试验

作     者：张体银 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘秀梵

授予年度：2004年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：重组鸡痘病毒,新城疫病毒融合基因,遗传稳定性,免疫保护效力,间接ELISA 

摘      要：新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的禽类的病毒性传染病之一，广泛流行于世界上许多国家和地区，给养禽业造成了巨大的经济损失。NDV属副粘病毒属，其病毒囊膜由两种蛋白组成，其中之一为融合蛋白(Fusion，F)，它参与病毒的融合与穿透，在疾病的免疫保护方面发挥着重要作用。我国目前仍以疫苗接种为主来控制该病，常用的油乳剂灭活苗和弱毒活苗对该病的控制起到重要作用，但其存在生产成本高，易散毒，使用后干扰ND疫情监测等缺点，因此，有必要研制新一代安全高效的基因工程疫苗。本实验利用本室分离的鹅源ZJ-1株NDV构建了表达F基因的4株重组鸡痘病毒(rFPV-SF、rFPV-SF、rFPV-SF和rFPV-SF)，并对其进行遗传稳定性分析和免疫效力试验。 1 表达ZJ-1株NDV F基因重组鸡痘病毒的筛选及其遗传稳定性测定 利用FuGEN6 Transfection Reagent进行转染，分别将含有NDV F基因的转移载体P11SF和PN11SF与282E4株和大空斑鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，通过蓝斑筛选，得到纯化的重组病毒rFPV-SF、rFPV-SF、rFPV-SF和rFPV-SF。PCR试验表明重组病毒基因组中含有F基因;间接免疫荧光试验(IFA)表明重组病毒中的F基因能够得到表达。 重组病毒经CEF连续传20代，覆盖含x-gal的琼脂，其在CEF上形成的空斑均为蓝斑。间接免疫荧光试验表明，重组病毒传20代后F基因的表达未受影响。取0、10和20代重组病毒DNA为模板进行PCR，均可扩增出约1.7 Kb的F基因片段。取rFPV-SF和rFPV-SF的0、10和20代PCR产物进行测序后与转移载体中的F基因相比，核苷酸和氨基酸无任何变化，显示了该重组病毒具有良好的遗传稳定性。 2 重组病毒的动物试验 2．1 重组病毒对SPF鸡的免疫效力 5日龄SPF鸡随机分为6组，进行皮下接种WFPV、rFPV-SF、 扬州大学硕士学位论文 rFPvL产SF^、亦PvZ:2以一SF。和:FPvLP一SFB lo4PFUz只，油苗为***/只，免疫后3 周龄用1护ELDS。F48E8株NDv进行滴鼻攻击。通过EusA抗体水平和保护效率 来评价重组病毒的免疫效力，结果除wtFPvLP组全部死亡外，其余组均100%保护。 2.2重组病毒对商品鸡的免疫效力 将26日龄商品鸡随机分为7组，以105PFu/只的量分别将wtFPvLP、 rFpVZ:2E4一sF^、rFpVLP一sFA、rFpVZsZE4一sF。和亦PVL产sF。进行皮下接种，油苗为 ***只，另外设空白对照组。免疫后21天以lo5ELnso F4sEs株Nnv滴鼻攻毒， 观察14天，其保护效率rFPVZsZE4一SF^、rFPVLP一SF^、rFPVZsZE4一SFB和:FPvLP一SFs 分别为64%、60%、52%、88%;油苗和WtFPVLP分别为1 00%、0。 3应用间接ELIsA检测鸡痘病毒抗体方法的初步建立 应用CEF扩增的鸡痘病毒(FPV)提纯后作为抗原建立了具有较高特异性和 灵敏性的间接ELIsA方法来检测FPV抗体。通过方阵滴定法来确定抗原最佳包被 浓度为2.7u留孔，待检血清最佳稀释倍数为1:100，其阳性临界值为OD妻0.098。 将400份FPV或者重组鸡痘病毒免疫过的实验鸡血清用本方法进行检测，其阳性 检出率为81.25%(325/4 00)。此外，将该方法与琼脂扩散试验进行比较检测血清 样品，结果显示本方法的灵敏度比琼脂扩散试验灵敏400一800倍，而且还有特异性 强，操作简便、快速等优点。 综上所述，本试验成功筛选了4株重组鸡痘病毒，并且具有良好的遗传稳定 性，对SPF鸡能提供100%的保护。该疫苗的研制成功将会加速新型基因工程疫苗 替代传统灭活苗的步伐，并将为ND的防制带来新的技术手段。