抗菌肽Pt5e高表达、纯化及其对多重耐药性细菌的抑菌活性

作     者：李智剑 

作者单位：中国海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张士璀

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：抗菌肽 高表达 阳离子类弹性蛋白 多重耐药性细菌 

摘      要：斑马鱼卵黄高磷蛋白(Pv)具有抑菌活性,活性中心位于C端的55个氨基酸残基,这段多肽即为抗菌肽Pt5,而Pt5e则是Pt5的一个抑菌活性更强的突变体(Pt5的第48位Arg突变为Leu)。Pt5e具有较强的抑菌活性和其他多种免疫调节功能,同时不会破坏人体的正常细胞,因此在许多领域表现出很高的研究价值和应用价值,特别是在抗生素滥用以及耐药性细菌不断出现的今天,Pt5e具有成为新型抗菌药物的潜力。目前对Pt5e的重组表达策略是以大肠杆菌为宿主,通过与His标签融合表达,使用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化。但是,在这一套异源表达和分离纯化系统下Pt5e的表达量相对较低,很难满足对Pt5e的进一步研究和开发的需要。因此,开发新型的Pt5e的高表达系统成为了解决这一问题的关键。类弹性蛋白(ELP)标签是一种新型的分离纯化重组蛋白的标签,只需要通过离心等步骤就能分离纯化得到目的蛋白,并且能够使目的蛋白的表达量有很大的提高。因此,本研究将一段经过设计的阳离子类弹性蛋白(CELP)标签与Pt5e融合表达,用以提高重组Pt5e的产量,并且测试其对多重耐药性(MDR)细菌的抑菌活性。首先,采用定向回归连接(RDL)法将4段合成的CELP[KV7F-9]单体基因串联成低聚化的CELP[KV7F-36]基因。接着对CELP[KV7F-36]基因和Pt5e基因进行修饰,在两段基因之间插入肠激酶底物的基因,用来在表达后去除CELP标签。构建完成融合蛋白表达载体pET28a-CELP[KV7F-36]-ENK-Pt5e后,使用大肠杆菌作为宿主,采用自诱导表达系统进行融合蛋白的重组表达。之后,通过可逆相变循环(ITC)分离纯化融合蛋白,并在肠激酶消化释放出重组Pt5e后通过同样的方法对重组Pt5e进行分离纯化。最后,比较CELP标签法与His标签法的产量,并测试重组Pt5e对MDR细菌的抑菌活性。结果表明,CELP标签与Pt5e融合表达后,可以通过ITC法顺利地将融合蛋白及重组Pt5e分离纯化,并能够大幅提高重组Pt5e的产量。CELP标签法生产重组Pt5e的产量为每100 mL培养基1.47 mg,是His标签法的近20倍。此外,重组Pt5e能够在较低浓度时杀灭实验用5株致病MDR细菌,表现出了较强的抑菌活性。透射电镜实验观察到重组Pt5e可以破坏实验用5株致病MDR细菌的细胞壁,造成细菌的死亡。