小鼠圆形精子、成熟精子细胞RNA-Seq文库的构建

作     者：张留光 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黎宗强

授予年度：2012年

学科分类：0907[农学-林学] 090705[农学-野生动植物保护与利用] 09[农学] 

主      题：圆形精子细胞 成熟精子 激光显微切割技术 转录组测序技术 

摘      要：小鼠精子增殖分化一步一步的发育成熟,这个过程很复杂。精原细胞经过有丝分裂,减数分裂和圆形精子拉长变态,最后形成带尾巴的成熟精子。精子发育后期即精子形成阶段,圆形精子细胞经过一系列的生化反应和形态结构变化变成长形精子细胞在附睾尾发育成具有繁殖性能的成熟精子。精子这一系列发育成熟过程都和相关基因的调控是分不开的。精子的过程可以看到一层层的各种精子细胞的结合,支持细胞、间质细胞和其他类型的生精细胞。人们采用不同的分离方法,试图分离到纯度较高的精子细胞,但总的来说,存在异质性的麻烦。为了阐明精子形成过程中的相关机理,筛选出生精细胞特异表达的基因势在必行。因此分离处于不同发育阶段的单一的、高纯度的生殖细胞群是进行相关研究的首要任务。 本课题组通过利用激光显微切割技术,从冰冻切片睾丸组织中成功捕获和分离到约3×104个小鼠的圆形精子细胞。同时用浮游法从小鼠附睾尾收集到了大量成熟的精子。并在此基础上从分离到的两种细胞中提取到了高质量的微量总RNA。RNA作为从父本把遗传信息传递到母本的中间载体,在好多方面的过程中都起着重要作用。作者采用最新发展起来的RNA-Seq技术对这两种细胞的转录组进行解析,并在转录组水平上研究精子形成过程中的相关机理问题。但是,由于小鼠精子作为精子发育成熟的终末最终细胞,其染色体由于鱼精蛋白的存在而高度浓缩,细胞核外只有一层细胞膜,并且细胞质非常少,RNA的含量极少,再加上激光显微切割所获得的细胞量也有限,所获得的RNA量根本无法满足RNA-Seq建库的需求,这就为我们的研究提出了一个挑战。本研究针对这一问题,我们对制备的总RNA中的mRNA采用了mRNA线性扩增技术,从而满足了建库所需要的RNA量。mRNA线性扩增技术导致扩增偏好型是极细微的,并且用aRNA进行基因表达研究的可重复性极高。 本论文首先通过激光显微切割技术和浮游法分别获得了纯净的圆形精子细胞、成熟精子,然后通过对这两种细胞的总RNA进行mRNA线性扩增达到了RNA-Seq技术建库所需的RNA量,成功构建了这个两个样品的RNA-Seq文库,为下游的转录组测序分析奠定了基础。