小鼠味蕾细胞分离纯化技术建立及应用研究

作     者：秦玉梅 

作者单位：浙江工商大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓少平

授予年度：2009年

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：ICR小鼠 菌状乳头 味蕾 α-gustducin Percoll 等温量热滴定 扫描电子显微镜 

摘      要：味觉是人和动物最基本、最原始也是至关重要的感觉功能,人和动物利用味觉来识别食物的性质、调节食欲和控制摄食量,而细胞界面原初味觉感受的产生是整个味觉产生的基础,但味蕾细胞分离技术的相对落后却制约着细胞层面味觉感受研究的进步。所以建立一种获取得率高、活性好、纯度高味蕾细胞的有效技术和味蕾细胞培养方法是现在亟待解决的问题。 本研究以ICR小鼠为实验动物,采用两步酶解法和操作简单的Percoll密度梯度离心法分离纯化小鼠味蕾细胞,通过亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫组化方法、电镜技术、荧光免疫技术、激光共聚焦显微技术相结合检测分离及纯化结果,从而建立了一套有效的小鼠味蕾细胞分离纯化技术。而后以建立的味蕾细胞分离纯化技术为平台,通过对纯化的味蕾细胞与直接法分离的味蕾细胞培养的比较,建立了一种味蕾细胞短期培养方法。最后对纯化的味蕾细胞进行等温量热滴定,检测不同甜味剂与味蕾细胞相互作用时的热量变化,初步探讨了细胞层面上味蕾细胞甜味识别热动力学研究的可行性。 实验结果如下: (1)小鼠味蕾细胞分离纯化技术研究,确定了分离纯化小鼠味蕾细胞各个环节的实验条件:两步酶消化法获取味蕾细胞悬液,胶原酶Ⅱ(1.5mg/mL)与中性蛋白酶Ⅱ(1.5mg/mL)1:1混合酶液用于剥离味觉上皮,分离条件室温下孵育6-8min(6-8周ICR小鼠);0.25%胰蛋白酶+0.02mmol/L EDTA37℃培养箱孵育味觉上皮10-20min制备混合细胞悬液。将混合细胞悬液铺于Percoll分离液中静置30min后,25℃1200rpm离心6min纯化味蕾细胞,纯化前后味蕾细胞的纯度显著提高,从少于10%到高于65%,电镜和免疫组化结果证明此方法的可行性与时效性。 (2)小鼠味蕾细胞体外培养方法的建立,通过实验得出以IMDM(含有1:5 MCDB153;10%FBS;20ng/mL insulin;100U/mL/100mg/mLpenicillin/streptomycin)作为培养液,以Ⅰ型鼠尾胶原作为贴壁因子,5%CO培养箱37℃培养,酶法分离的味蕾细胞培养效果优于直接法分离的味蕾细胞。而且增殖实验及免疫组化结果表明虽然味蕾细胞在培养两周后仍然具有与味觉感受相关的关键分子α-gustducin等,但味蕾细胞在体外的增殖能力较弱,只适合短期培养。 (3)同种浓度的不同甜味剂与味蕾细胞相互作用的等温量热结果表明,不同甜味剂与味蕾细胞的相互作用的热量变化与其甜度具有一定相关性,甜度越高其热效应结果的绝对值越高。初步证明利用等温量热技术从细胞层面上研究味觉感受的可行性,为后续研究奠定技术基础。