白细胞介素13通过H3K4me3修饰调节人鼻黏膜上皮细胞分化的研究

作     者：于蕾 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李娜

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100213[医学-耳鼻咽喉科学] 10[医学] 

主      题：鼻息肉 H3K4me3 白细胞介素13 人鼻黏膜上皮细胞 H3K4me3modification MLL1 

摘      要：第一部分H3K4me3在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及临床意义目的:对蛋白H3K4me3在慢性鼻窦炎伴鼻息肉组织及正常下鼻甲组织中表达水平进行比较,以探究其在鼻息肉发病过程中的临床意义。方法:收集2016年3月到2016年12月我院诊治慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者11例,用Lund-Kennedy方法评估鼻息肉患者病情程度,以鼻息肉患者的鼻息肉组织为实验组,以同一患者正常的下鼻甲黏膜组织为对照组。对11例鼻息肉组织及正常鼻黏膜组织分别进行Western blot检测H3K4me3蛋白的表达水平;用RT-PCR检测两组组织中FOXJ1 m RNA、CLCA1 m RNA、DNAI2 m RNA、MUC5a m RNA m RNA的表达量,用△CT法进行相对定量分析,△CT与m RNA的表达量成反比。本研究用Prime 6.0软件软件对数据进行分析。结果:*** blot结果显示鼻息肉组织中蛋白H3K4me3表达量明显升高,息肉组织中蛋白水平灰度值比的均数±标准差(0.62±0.07);对照组中下鼻甲黏膜组织中蛋白H3K4me3表达量明显降低,黏膜组织中蛋白水平灰度值比的均数±标准差(0.31±0.07),两者差异有统计学意义(t=2.18,P0.05);***-PCR结果显示,鼻息肉组织中FOXJ1m RNA和DNAI2m RNA的△CT值明显高于正常下鼻甲黏膜组织,MUC5am RNA和CLCA1m RNA的△CT值明显低于正常下鼻甲组织黏膜组,并且各组之间差异有统计学意义(P0.05),差异具有显著统计学意义(P0.01);病变鼻息肉组织中的FOXJ1m RNA和DNAI2m RNA相对于正常下鼻甲黏膜组织表达降低,而病变鼻息肉组织中的MUC5am RNA和CLCA1m RNA较正常下鼻甲黏膜组织表达增高,且均有统计学意义。结论:H3K4me3蛋白可能参与了慢性鼻窦炎伴鼻息肉炎症反应的发生和维持过程,组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)有可能作为治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉的新靶点。第二部分IL-13对人鼻黏膜上皮细胞H3K4me3表达的影响及意义目的:在体外培养的人鼻腔黏膜上皮细胞的模型上,探索白细胞介素13(interleukin-13,IL-13)对上皮细胞分化的影响以及H3K4me3修饰和组蛋白甲基化特异性转移酶(mixed-lineage leukemia 1,MLL1)在IL-13调控细胞分化中发挥的作用,为治疗鼻腔炎性疾病提供新的切入点。方法:体外分离培养人鼻腔黏膜上皮细胞,用不同梯度浓度的IL-13处理后,以β-tubulin为对照,western blot检测蛋白H3K4me3的表达水平,选取合适的IL-13(10ng/ml)的浓度进行下一步实验。经IL-13处理后的人鼻腔黏膜上皮细胞中,用RT-PCR检测鼻黏膜上皮细胞分化关键基因FOXJ1、DNAI2、CLCA1和MUC5a以及H3K4me3相关的组蛋白甲基化相关基因MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、MLL5、SETD1A和JARID1B的表达;以及western blot检测H3K4me3的特异性甲基转移酶MLL1蛋白的表达水平。Knockdown MLL1后,通过western blot和RT-PCR检测knockdown MLL1的效果;随后利用RT-PCR重复检测经knockdown MLL1处理后的鼻黏膜上皮细胞分化关键基因FOXJ1、DNAI2、CLCA1和MUC5a的表达与knockdown处理之前表达是否有差异性结果:与对照组相比,经过IL-13处理后,处理后的鼻黏膜上皮细胞中蛋白H3K4me3的表达水平显著升高,基因FOXJ1和DNAI2的m RNA呈低表达(P0.05),而CLCA1和MUC5a的m RNA呈高表达(P0.05);H3K4me3相关的组蛋白甲基转移酶MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、MLL5和SETD1A的m RNA表达升高,而组蛋白去甲基化转移酶JARID1B的m RNA表达降低,其中MLL1的m RNA表达较其它转移酶升高的较明显,western blot结果表明蛋白MLL1的表达也升高;与经IL-13处理的鼻黏膜上皮细胞相比,knockdown MLL1处理后,蛋白H3K4me3和MLL1表达水平下降,MLL1的m RNA呈低表达,RT-PCR结果显示FOXJ1和DNAI2的m RNA呈高表达(P0.05),而CLCA1和MUC5a的m RNA呈低表达(P0.05)。结论:从蛋白水平和基因水平检测H3K4me3和MLL1结果一致,均发现IL-13刺激组中H3K4me3和MLL1表达增高,存在H3K4me3修饰升高。