脱落乳牙牙髓干细胞聚合体用于牙髓再生的实验研究

作     者：郭皓 

作者单位：第四军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：轩昆;金岩;李蓓

授予年度：2015年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：乳牙牙髓干细胞 细胞聚合体 牙本质牙髓复合体 牙髓再生 

摘      要：牙髓再生是现今研究的热点,最主要的研究方法是基于组织工程原理,利用间充质干细胞结合生物支架材料进行异位和原位的组织重建。目前实验研究多数为前瞻性的组织学和动物模型探索,但至今尚未实现具有完整组织形态结构和良好生理功能的牙髓再生。此外由于间充质干细胞的应用方式和生物支架的材料性能存在伦理学限制和生物安全性验证,要进行临床试验应用仍需进一步深入研究。要真正实现具有生理功能性牙髓再生的临床应用,种子细胞的来源、支架材料的选择以及有效的诱导微环境是亟待解决的关键问题。脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)是源于脱落器官的一类处于发育早期的牙源性干细胞,具有良好的生物学性能,包括较高的增殖能力、更为广泛的多向分化能力、以及良好的免疫调控能力;并且其临床来源也更为广泛,便于自体的组织再生应用。此外近年来出现的细胞聚合体(aggregate)是一种先进的组织工程学技术,其不但可以保持干细胞活性,拥有良好性能的生物支架-自分泌的细胞间基质,而且富含细胞生长和分化所需的诱导因子。本研究拟通过乳牙牙髓干细胞聚合体的生物学性能检测、牙髓牙本质复合体组织再生实验,明确其用于全牙根牙髓再生的可行性,进而利用动物模型的治疗实验,探讨乳牙牙髓干细胞聚合体治疗年轻恒牙牙髓坏死的效果,以期为儿童牙体牙髓疾病治疗提供新的治疗理念和策略,并为临床试验应用提供理论依据和实验基础。第一部分脱落乳牙牙髓干细胞聚合体生物学性能的实验研究目的:明确脱落乳牙牙髓干细胞及其聚合体的生物学性能。方法:分离和培养人类脱落乳牙的牙髓干细胞与恒牙牙髓干细胞(dpsc),检测并比较两者分子表面标记、克隆形成能力、增殖水平以及多向分化能力;进而诱导制备shed细胞聚合体,通过组织学、免疫组织化学方法检测其生物学性能。结果:脱落乳牙牙髓干细胞与牙髓干细胞均能够阳性表达间充质来源的表面标志stro-1,cd90和cd146,而造血系来源标志物cd34为阴性。shed细胞在克隆形成能力、增殖水平、成骨成脂分化能力方面均高于dpsc。制备的shed细胞聚合体厚度适中、质地坚韧;he染色观察shed细胞聚合体含有较多的未分化细胞以及丰富的细胞外基质;masson染色可见交联呈网状结构的胶原纤维。结论:乳牙牙髓干细胞及其聚合体具有良好的生物学性能,是一类理想的种子细胞和适宜的牙髓再生应用方式。第二部分乳牙牙髓干细胞聚合体构建牙髓牙本质复合体的实验研究目的:探索shed细胞聚合体用于组织工程构建牙髓-牙本质复合体的实验方法。方法:收集正畸拔除牙齿,根管清理并制备全长牙根组织支架;实验组根管内植入shed细胞聚合体,对照组根管内充填氢氧化钙糊剂,而后移植裸鼠皮下孵育,术后3月组织学取材;获取根管内的再生组织,细胞分离并培养,对其表面分子标记、克隆形成能力、增殖水平以及成骨成脂分化能力检测并与shed细胞进行对比;同时取材组织脱矿后利用he、免疫组化染色等方法评估异位再生情况。结果:组织学检查发现实验组的再生组织几乎充盈整个根管,类似正常牙髓组织,免疫组化染色可见组织中dspp、cd31、nestin均为阳性表达,也证明其具有继发性牙本质、成牙本质细胞层、血管及神经组织结构;再生组织细胞具有与shed细胞相同的表面分子标记,同时其克隆形成能力、增殖水平以及多向分化能力均与shed细胞相似;免疫荧光染色显示再生组织的大部分血管及神经源于shed细胞分化而来;而对照组根管内可见钙化团块及肉芽结缔组织的混杂结构。结论:shed细胞聚合体在牙根管内微环境中可以异位再生形成正常形态的牙髓-牙本质复合体结构。第三部分乳牙牙髓干细胞聚合体用于牙髓再生的动物学实验目的:利用动物实验模型检测小型猪(mini-pig)乳牙牙髓干细胞(SPED)细胞聚合体进行原位牙髓再生的应用效果。方法:分离和培养Mini-Pig的乳牙牙髓干细胞,检测和分析其细胞生物学行为,进而诱导制备SPED细胞聚合体;建立年轻恒牙牙髓坏死的实验动物模型,设置SPED聚合体再生组、传统根尖诱导成形治疗组和正常牙髓对照组;术后4月进行受试牙齿牙髓活力反应测试,而后常规组织学取材,利用HE、免疫组化、免疫荧光染色等方法观察牙髓再生和牙根尖形成情况。结果:放射学检查显示SPED聚合体再生组牙根继续发育,并且对机械刺激出现牙髓疼痛反应;组织学HE染色检测发现再生组受试牙齿牙根继续发育并形成正常的根尖形态,此外全长根管内可见类牙髓结构的再生组织;免疫组化和荧光染色可见组织中CD31、Nestin、CGRP、TRPV1、TRPM8表达阳性细胞的规则分布,与正常牙髓对照组类似;而传统根尖诱导成形治疗组仅在根端形成不规则圆钝的根尖结构,根管内未见牙髓组织形成。结论:SPED聚合体可以实现全长牙根的原位牙髓再生,再生组织不仅具有正常形态结构,而且具有牙本质形成、牙髓感觉、诱导牙根尖成