高产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的诱变育种与发酵优化

作     者：余明洁 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈卫

授予年度：2008年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：ε-聚赖氨酸 白色链霉菌 生物防腐剂 诱变 发酵优化 

摘      要：ε-聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)是80年代由日本首先发现由微生物发酵产生的一种新型食品抑菌剂,其化学组成是由人体必需氨基酸L-赖氨酸构成的多肽,它经消化后又可变成单一的赖氨酸而成为人体营养的强化剂,已作为GRAS物质通过了美国FDA认证,CAS登记号为28211-04-3,标志着ε-聚赖氨酸已被国际标准所认可。故聚赖氨酸作为食品防腐剂,具有无毒副作用,安全性高的特点。 本课题对实验室保存的一株具有ε-聚赖氨酸生产能力菌株白色链霉菌Streptomyces albulus SA进行研究,通过对其分泌产物与带电染料的静电作用及Dragendorff试剂反应和产物的氨基酸组成分析可以得出,ε-聚赖氨酸带正电荷,是一种生物碱物质并且为L-赖氨酸的聚合物。通过以上实验,为筛选和验证具有ε-聚赖氨酸生产能力的菌株提供了简便而快捷的方法。 对白色链霉菌Streptomyces albulus SA进行诱变选育,首先研究了紫外线复合氯化锂诱变中不同的照射剂量对细胞存活率的影响得到了致死率曲线,根据遗传育种的经验,正向突变较多发生在偏低剂量中,确定了以25 s作为最适紫外诱变剂量。初筛采用打孔琼脂柱抑菌圈法可以大批量并快速选出抑菌效果显著的菌株,经过复筛得到一株产量为1.33 g/L的突变株UL2-7,产量提高了27.9%。 以紫外诱变获得的突变株UL2-7作为出发菌株,进行亚硝酸诱变筛选AEC抗性菌株,根据诱变剂量对细胞存活率的影响得到了致死率曲线,确定20 min的处理时间作为最适亚硝酸诱变剂量。通过复筛得到高产菌株UN2-71,ε-聚赖氨酸产量为1.64 g/L,提高了57.7%。 对诱变得到的菌株UN2-71进行发酵稳定性能研究,经过5次传代实验结果表明突变株性状稳定,并对白色链霉菌UN2-71的培养特性及生理生化特性进行了观察。 对不同碳源和氮源对ε-聚赖氨酸产量的影响进行了研究,得到可溶性淀粉是最佳碳源,而(NH)SO和酵母提取物的组合是最佳氮源。在碳源、氮源优化的基础上,进行摇瓶发酵培养基的优化,对培养基八种成分可溶性淀粉、硫酸铵、酵母提取物、K2HPO4、KHPO、MgSO·7HO、ZnSO·7HO、FeSO·7HO进行了Plackett-Burman筛选试验,得到可溶性淀粉、硫酸铵和酵母提取物为显著影响因素,对这三因子进行三水平的Box-Behnken试验,通过RSM分析得到优化模型,优化后的培养基组成为:可溶性淀粉40 g、硫酸铵8 g、酵母提取物6.4557 g、K2HPO4 0.8 g、KHPO4 1.36 g、MgSO·7HO 0.75 g、ZnSO·7HO 0.06 g、FeSO·7HO 0.045 g。在最优条件下,ε-聚赖氨酸预测产量达到2.54 g/L,验证实验结果为2.48 g/L。