L-酪氨酸微生物转化及代谢产物分析鉴定

作     者：尚新达 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴健

授予年度：2014年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

主      题：L-酪氨酸 微生物转化 16SrDNA分子鉴定 正交优化 分离提取 NMR、MS结构鉴定 

摘      要：L-酪氨酸(L-tyrosine，Tyr)属芳香族氨基酸，在生物体内代谢产物丰富多样，其中许多具有重要生理功能和药理特性，而且在发酵食品中其产物种类和含量会对食品的安全和生理效应产生重要影响，因此深入研究微生物对L-酪氨酸的转化产物很有必要。同时，通过微生物转化的研究可以开发L-酪氨酸代谢产物更为清洁高效的生物酶生产方法，对于推动其重要代谢产物在食品、医药、饲料、化工、疾病检测等领域的广泛应用具有重要研究价值和实践意义。 本研究从自然界富集得到106株菌株，通过初筛、复筛和重复对比实验，筛选得到菌株ZL-20，在不同条件下可转化得到8个产物。16S rDNA分子鉴定和系统发育进化树显示与Bacillus megaterium同源率高达99.0%，结合其生理生化试验综合分析后鉴定为巨大芽孢杆菌。通过对其产酶培养基和转化条件等的优化，得到了其中3个主要产物各自单一产生的条件，并使转化率和转化浓度得到较大幅度提高。其中，产物①优化后24h转化率达到65%以上，较优化前提高21%左右;产物②36h转化率达到75%以上，较优化前提高33%左右;产物③48h转化率高达98%，较优化前提高25%左右。 在此基础上，通过转化液预处理、有机溶剂萃取、离子交换树脂分离、Prep-HPLC制备等对目标产物进行分离提取，并运用等电点冷却结晶、浓缩结晶以及重结晶等方法进一步纯化，经HPCE和HPLC纯度检测，产物①晶体纯度达98%以上，产物②达96%以上，产物③达95%以上。最后采用NMR和MS技术分别对三个转化产物进行结构鉴定，并结合ZL-20菌株16S rDNA分子鉴定结果和KEGG Pathway Database中L-酪氨酸代谢通路进行综合分析。结果表明：产物①为L-多巴，化学式为C9H11NO4，属于黑色素途径，L-酪氨酸经多酚氧化酶等羟基化而生成;产物②为4-羟基-烯醇-苯酮酸，化学式C9H8O4，属于氧化分解途径，首先经天冬氨酸转氨酶等作用生成对羟苯基丙酮酸，再经苯丙氨酸互变异构酶催化生成;产物③为对羟基苯乙胺，化学式C8H11NO，也属于氧化分解途径的一个分支，是L-酪氨酸在酪氨酸脱羧酶等作用下氧化脱羧生成。其中，苯丙氨酸互变异构酶在NCBI的Gene数据库中已知的菌属类型并没有芽孢杆菌。因此推测，该酶可能是在芽孢杆菌中未被发现的一种新酶。 综上，本研究筛得的菌株ZL-20稳定性好，转化产物丰富;经条件优化和分离提取，对其中三个产物顺利完成了分析鉴定，建立起了一套L-酪氨酸代谢产物分析研究的有效方法。为后续更多新产物的发现、具有工业应用潜力酶资源的开发及发酵类食品安全性评估等的进一步研究奠定了坚实的基础。