松花粉酶解多肽及其抗氧化活性的初步研究

作     者：陈文媛 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：耿越

授予年度：2010年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：云南松花粉 活性肽 酶解条件 抗氧化活性 

摘      要：松花粉是一种营养十分丰富的天然资源,近年来对其中多糖类物质以及脂肪酸都进行了全面的深入研究,但对于松花粉中的活性物质研究却鲜有报道。蛋白质是人体生命的最重要的基本物质,多肽则是蛋白质链的分解产物,具有生物活性的多肽片段在人体内具有多种重要功能,比如抗氧化、降血压、抗疲劳、抑制肿瘤、促进各种有利于人体的微量元素被吸收,因此,活性多肽的制备成为现在生物工程研究领域的热门。本课题以实验室自制的云南松花粉粗提蛋白为原料,利用碱性蛋白酶对云南松花粉粗提蛋白进行水解,并对其酶解条件进行优化,对得到的酶解多肽进行超滤纯化,并在化学体系及细胞体系下进行抗氧化的初步研究,为进一步研究松花粉蛋白质奠定基础。结果如下: 1.选用碱性蛋白酶酶解松花粉粗提蛋白,以羟自由基清除率和水解度为测定指标,通过单因素实验和正交试验优化酶解条件,确定抗氧化肽的最佳酶解条件为:pH=9.0、温度为50℃、底物浓度为3%、酶浓度为4000U/g,酶解时间为2小时,在此条件下羟自由基清除率可以达到67.6%。 2.云南松花粉酶解多肽(PHPP)在体外的抗氧化研究,在PHPP浓度为7.5mg/mL时对超氧阴离子自由基清除率可达到64.45%,在浓度为30mg/mL时对羟自由基的清除率达到72.99%,在浓度为3mg/mL时对DPPH自由基的清除率为42.48%。 3.离心超滤法对酶解多肽(PHPP)纯化浓缩,得到的酶解多肽纯化组分简称为PPHPP。对PPHPP进行了全面的抗氧化研究,在其浓度为7.5mg/mL时对超氧阴离子自由基清除率可达到92.48%,在浓度为30mg/mL时对羟自由基的清除率达到80.80%,在浓度为3mg/mL时对DPPH自由基的清除率为70.83%,与超滤前PHPP相比,清除率均有不同程度的提高,说明离心超滤法对于提纯蛋白、去除杂质、增强酶解多肽活性发挥了很大的作用。 ***法检测PPHPP对过氧化氢损伤的H9C2心肌细胞株的保护作用,结果表明,加入PPHPP共孵后再进行过氧化氢损伤的样品组,其OD值较于损伤模型组有不同程度的提高,且终浓度为50、100、500μg/mL的PPHPP组分对心肌细胞的保护作用明显,其OD值与模型组相比为极显著差异(P0.01)。 5.用SOD、MDA检测试剂盒测定H2O2模型组及加入PPHPP后的心肌细胞损伤组的SOD和MDA值,模型组中SOD的活力较空白组显著降低(P0.01),过氧化物产物MDA的含量显著升高(P0.01),但是在PPHPP加样组中,SOD的活力相对于模型组显著提高(P0.01),过氧化物产物MDA的含量明显降低(P0.05),这同样表明了加入PPHPP样品后的心肌细胞一定程度上减小了对H2O2的应激反应,起到了保护心肌细胞的作用。