甘蓝型油菜转基因体系的建立与PWY86及TLW10表达载体的遗传转化

作     者：谭茂玲 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：梁国鲁;魏文辉

授予年度：2011年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：油菜 转基因 特异性位点重组 基因叠加 

摘      要：油菜是世界四大油料作物之一,在农业生产中以及工业用途上占重要地位。甘蓝型油菜是三种油菜中籽粒产量最高的种类,是目前油菜生产上栽培的主要品种。一些传统的杂交育种方法已经不能满足培育抗/耐病虫害、抗杂草以及改善品质的需要,转基因技术的发展给我们提供了一个新途径。目前导入外源基因的方法主要是农杆菌的转化法。在甘蓝型油菜的转化实验中,农杆菌的菌株,外植体的选择,侵染的浓度,培养基中激素的配比以及抗生素的筛选压力都会影响转基因植株的获得。本实验通过对这些影响因素做对比实验,选择出适宜的条件及浓度,优化了农杆菌的再生转化体系。另外将PWY86以及构建的TLW10载体采用农杆菌转化法分别转化甘蓝型油菜‘中油821’,并对转基因植株进行了分子鉴定,从而证明了这个再生转化体系的可行性。 1、TLW10转化载体的构建 以双元载体pBI121为基础,将Frt-GFP-Tnos片段插入载体HindⅢ位点,并通过PCR和酶切检测,成功的构建了TLW10转化载体。 2、再生体系的建立 以甘蓝型油菜‘中油821’为实验材料,以MS培养基为基础,初步建立了再生体系：用农杆菌菌株EHA105具有更高的侵染效率;用甘蓝型油菜‘中油821’的带子叶的子叶柄为受体,并且苗龄为4D时具有更高的转化率;侵染的农杆菌稀释成OD值为0.1,AS的浓度为15mg/L,2,4-D1 mg/L AgNO3的浓度为5 mg/L,6-B,A与NAA的浓度组合为3mg/L及0.1mg/L;筛选压力用的草钱磷除草剂为7 mg/L,卡那霉素为13mg/L。 3、PWY86及TLW10载体的遗传转化及分子检测 以甘蓝型油菜‘中油821’为受体材料,导入载体PWY86及TLW10,将转化得到的阳性植株进行分子检测,实验结果如下：(1)转化PWY86载体获得的阳性植株用PCR和PCR-southern blot杂交实验检测,PCR实验中用设计的引物扩增Bar基因序列,得到456bp的特异性条带,这与预期结果相符,初步表明PWY86载体成功转入宿主体内。PCR-southern blot杂交实验也得到与FLP序列杂交的特异性条带,由此表明：用PWY86载体转化甘蓝型油菜‘中油821’获得抗性植株。(2)将转化TLW10载体获得的阳性植株进行PCR实验和GUS染色,PCR试验中用设计的引物扩增NPTⅡ基因序列,得到672bp的特异性条带,与预期结果相符,初步表明TLW10载体成功转入材料体内。GUS染色结果发现在转化植株的根、茎、叶和花蕾中都有GUS基因的表达,表明用TLW10载体转化甘蓝型油菜中油821获得抗性植株。