鸡源LSm14A序列分析与NDV对LSm14A表达水平影响研究

作     者：伍昌华 

作者单位：贵州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：温贵兰

授予年度：2016年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：LSm14A 原核表达 真核表达 组织分布 NDV 

摘      要：LSm14A作为一种新型病毒核酸受体,是天然免疫中作为重要的抗病毒免疫分子,在抵御多种病原的入侵中起着重要作用。当前关于LSm14A与新城疫病毒相互作用的研究很少,具体抗病毒机制尚不清楚。本研究通过扩增不同鸡源LSm14A(c LSm14A)基因并对该基因序列进行详尽分析和功能预测,通过构建鸡LSm14A的表达质粒,利用荧光定量方法,从分子水平阐明在鸡体不同组织中LSm14A的分布与表达特征,然后以c LSm14A和不同NDV毒株为研究对象,初步探明NDV对c LSm14A转录水平的影响。试验结果将为深入研究NDV与宿主天然免疫之间的关系奠定基础,加深人们对病毒调控宿主关键信号分子的认识,为防治NDV提供新的思路,同时对探索天然免疫作用具有重要意义。1.c LSm14A基因的克隆与生物信息学分析本研究通过RT-PCR获得倒毛鸡、绿壳蛋鸡和高脚鸡c LSm14A编码区片段,所得条带均与预期大小相符,约为1386 bp,编码461个氨基酸和一个终止密码子。测序结果通过NCBI Blast分析发现,倒毛鸡、绿壳蛋鸡和高脚鸡c LSm14A序列与Gallus(Gen Bank登陆号:NM01012778.1)的序列相似度分别为100%、99%、99%。对获得的3种鸡源氨基酸序列与参考原鸡序列进行比较分析,4种鸡源的氨基酸相似性很高,未出现氨基酸残基的缺失及插入,仅存在小部分氨基酸残基点突变,其中绿壳蛋鸡氨基酸序列第78aa、135aa、180aa、300aa发生突变C/R、G/R、Q/H、E/K,高脚鸡第116aa发生突变C/R。将获得的3种c LSm14A序列与其他动物物种的LSm14A建立进化树分析发现,3种鸡源的序列与原鸡源在同一分支,与鸭源、企鹅、金雕、水鸟等鸟纲动物亲缘关系较近;与猴源、鼠源、猪源等哺乳动物及爪蟾的LSm14A亲缘关系较远。不同物种的LSm14A氨基酸比对结果显示LSm14A的N-端高度保守。3种c LSm14A蛋白均无跨膜结构,在1-75aa之间含有Sm结构域,在289-399aa含有FDF结构域。3种鸡源的c LSm14A蛋白不存在信号肽,即为非分泌蛋白。本研究获得的关于LSm14A的基因水平、蛋白质一级结构和蛋白质二级结构及亚细胞定位相关信息,可以为进一步研究该基因原核表达及组织表达差异奠定理论基础。2.c LSm14A原核表达与抗原性分析根据RT-PCR获得倒毛鸡c LSm14A保守区域片段,将其克隆至原核表达质粒p Cold I,并将重组质粒转化至BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,His-tag镍柱亲和层析纯化表达的重组蛋白,纯化重组蛋白r His-c LSm14A分别免疫小鼠与兔子制备相应的多克隆抗体,利用ELISA与Western Blotting方法分析c LSm14A的免疫原性。结果显示:SDS-PAGE结果显示重组蛋白主要以包涵体形式存在;鼠源、兔源抗c LSm14A多克隆抗体ELISA效价均高于1:3200。Western Blotting结果显示,重组表达蛋白分别被His抗体、鼠源与兔源抗c LSm14A多克隆抗体所识别,免疫印迹显示的蛋白条带与SDS-PAGE分析的条带大小一致,约为19.6k Da。本研究成功制备了兔、鼠源抗c LSm14A的多克隆抗体,试验结果为本研究进一步分析c LSm14A的表达情况以及开展c LSm14A抗病毒作用提供储备。3.c LSm14A真核表达载体构建与表达通过RT-PCR获得的倒毛鸡c LSm14A全长CDS区序列,将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+),获得了重组真核表达质粒pc DNA3.1(+)-c LSm14A。选用的Lipofecter脂质体作为转染试剂,转染HEK293细胞。通过间接免疫荧光检测真核表达重组质粒pc DNA3.1(+)-c LSm14A以及空载体质粒转染细胞后目的基因的表达情况。结果显示,c LSm14A能在HEK293细胞中表达,主要分布于细胞浆内。4.鸡源LSm14A在绿壳蛋鸡组织分布与NDV对LSm14A表达水平影响研究本研究利用q PCR方法检测c LSm14A在绿壳蛋鸡不同组织的分布情况,探明LSm14A分子在绿壳蛋鸡不同组织的分布特征。结果显示:LSm14A在绿壳蛋鸡肝脏、胸腺、肾脏、大脑、小肠、肺脏、脾脏、心脏、法氏囊组织中有不同程度的转录水平表达,且各组织之间的转录水平差异较大。其中,在法氏囊和胸腺中的转录水平相对较高,法氏囊中的转录水平明显高于其他组织;肾脏、大脑、小肠、肺脏、脾脏、心脏中的转录水平相对较低;在肝脏转录表达水平最低。选取NDV不同毒株F48E8、La Sota、P3、H2和TN,测定试验毒株EID50值,采用点眼、肌肉注射的方法感染未免疫鸡。感染12h、24h、48h、72h后,采集不同组织提取总RNA,反转录合成c DNA,利用q PCR方法检测NDV感染后不同时间点不同组织的c LSm14A转录水平变化。结果显示:感染NDV与未感染相比,感染NDV后c LSm14A转录水平出现明显的升高趋势。结论:1.本研究成功克隆了倒毛鸡、绿壳蛋鸡和高脚鸡的c LSm14A编码区,经序列分析发现该基因高度保守,与NCBI提供的原鸡参考序列相似度达99.6%-100%。生物软件分析发现3种c LSm14A基因编码的蛋白结构中,含有大量的α-螺旋和β-转角,无跨膜结构,含有Sm与FDF基序,均为非分泌蛋白。2.本研究利用原表达系统成功表达了c LSm14A蛋白,获得了高效价的兔源与鼠源抗c LSm14A多克隆抗体,多克隆抗体可特异性识别纯化的原核表达蛋白,说明原核表达的c LSm14A蛋白具有良好的免疫原性。3.本研究成功构建了重组真核表达质粒pc DNA3.1(+)-c LSm14A,c LSm14A能在HEK293细胞中表达,主要分布于细胞浆内。4.本研究成功探明了c LSm14A在鸡肝脏、胸腺、肾脏、大脑、小肠、肺脏、脾脏、心脏、法氏囊组织中转录水平特征,试验结果显示c LSm14A在鸡体特殊的中枢免疫器官法氏囊中的转录水平最高。NDV感染早期c LSm14A转录水平迅速升高,说明c LSm14A在早期抗病毒感染方面具有重要的作用。