以HSP110为佐剂的宫颈癌纳米颗粒疫苗可有效延长荷瘤小鼠存活率

作     者：张月 

作者单位：蚌埠医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：唐隽;倪兵

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：宫颈癌 多肽疫苗 HPV16 E749-57 RGD HSP110 

摘      要：一、目的本研究基于阳离子肽类DNA转运载体的研究进展,提出一种新型纳米颗粒疫苗设计方案。其中选用具有靶向肿瘤细胞的作用的RGD-GGG-K作为阳离子肽;选用HSP110作为佐剂,可诱导机体产生肿瘤特异性或病毒特异性免疫反应;将HSP110与HPV16 CTL表位E7融合克隆于表达EGFP的双表达盒质粒中,然后通过与富含正电荷的RGD-GGG-K多肽之间的电性中和作用发生聚合、压缩,从而形成几十纳米的致密颗粒,通过RGD-GGG-K靶向肿瘤细胞的特性,使纳米颗粒易被肿瘤细胞摄入且保护DNA免于核酸酶的降解,如此达到基因转染的目的。总的来说,本研究打算构建一种新型的HPV16多肽疫苗,通过化学合成RGD-GGG-K多肽,并通过静电引力作用与带负电荷的重组双表达质粒pIRES2-3×E7-HSP110-EGFP质粒形成复合物并自组装成纳米颗粒。体内外探讨该新型疫苗是否能提高免疫学应答和抗肿瘤效应,同时,探讨这种作用的分子机制。二、方法1.将HSP110基因和E7编码DNA序列融合克隆于表达EGFP的双表达盒质粒中,化学合成RGD-GGG-K,再利用K所带的丰富正电荷与上述重组质粒所带的负电荷通过静电聚合作用,形成纳米病毒样颗粒疫苗,并通过凝胶阻滞实验、DNase I保护实验、透射电镜和粒度分析等方法对纳米颗粒进行鉴定;通过免疫荧光、竞争抑制试验、Western-blot方法检测该纳米颗粒能否将外源基因转入哺乳动物细胞。2.通过CCK8、流式细胞术(FCM)体外检测纳米颗粒对肿瘤细胞活力的影响。3.通过细胞内染色及FCM、体外特异性细胞毒CTL-LDH释放实验、分析疫苗诱导的免疫应答和其介导的CTL毒性效应。4.构建治疗性及预防性肿瘤动物模型,观察RGD-GGG-K/pIRES2-3×E7-HSP110-EGFP纳米颗粒疫苗在动物模型体内的抗肿瘤效应。三、结果1.成功构建RGD-GGG-K/pIRES2-3×E7-HSP110-EGFP纳米颗粒,确定最适多肽/DNA电荷比r=2.0;当r=2.0时所制备的颗粒为大小均匀一致,类圆形,绝大部分颗粒直径约50nm左右;在体外该纳米颗粒可将HSP110基因带入肿瘤细胞内。2.该纳米颗粒疫苗在体外对肿瘤细胞无促进增值与凋亡作用,体外和体内均很大程度上提高了抗原表位特异性的免疫原性,显著增强抗原特异性CTL应答及其产生的细胞毒效应。3.该纳米颗粒疫苗能有效保护C57BL/6小鼠免受肿瘤细胞的攻击,并且能够明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长,延长其存活时间,提高存活率。四、结论综上分析,我们在本研究中设计并合成的RGD-GGG-K/pIRES2-3×E7-HSP110-EGFP纳米颗粒疫苗通过体内外研究证实了其具有良好效果。因此,该疫苗为为进一步开发潜在HPV免疫治疗奠定基础;还可通过对该疫苗免疫学作用及相关机制的研究,可为其他肿瘤的特异性预防和治疗提供全新的思路和实验技术,具有广阔的潜在实际应用价值。