钙调神经磷酸酶/活化T细胞核因子信号通路在大鼠主动脉平滑肌细胞钙化中的作用

作     者：李秀芩 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李绍冰

授予年度：2011年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：钙调神经磷酸酶 活化T细胞核因子 高磷 主动脉平滑肌细胞钙化 环孢霉素A 

摘      要：目的:血管钙化是由于高钙、高磷环境及局部或全身矿化诱导因子上调、抑制子下调所导致骨特异性羟基磷灰石结晶主动沉积在血管壁的病理生理过程。心血管系统钙化包括心脏瓣膜钙化、与动脉粥样硬化关系密切的内膜钙化和动脉中层钙化(Mo¨nckeberg’s sclerosis),常见于老年人及高血压、冠心病及合并糖尿病、慢性肾病等患者,其钙化程度与疾病的严重性呈正相关,并随年龄的增长而呈现渐进的恶化趋势。目前研究表明,血管钙化的过程是一个主动的、细胞可调控的过程,类似于骨的形成过程,正如软骨内成骨和膜内成骨的形成过程。在这一病变发展过程中,血管壁矿化防御机制被减弱甚至耗竭,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)、内皮细胞(endothelial cell,EC)等间叶细胞的表型发生转变,由原有表型转化为成骨细胞表型,并释放矿化脂质小泡。脂质小泡在动脉壁上至少存在基质小泡和凋亡小体两种形式,它为钙化结晶提供了合适的成核微环境,而羟基磷灰石沉积的支架结构则由血管壁的弹性蛋白提供。因此钙沉积(成骨细胞样细胞介导)与钙吸收(破骨细胞样细胞介导)之间的动态平衡一旦被打破后,血管壁或动脉瓣膜就可能形成异位钙化。 钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)又称蛋白磷酸酶2B(PP2B),属丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员,是目前所知的唯一一种受Ca/钙调素(Calmodulin,CaM)调节的丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶,在细胞信号传递过程中直接受Ca的调节,起去磷酸化作用。目前认为,CaN是一种广泛分布在脑、心肌、血管平滑肌和心血管内皮、骨骼肌、T淋巴细胞等免疫与非免疫组织细胞中,是一种参与多细胞、多系统功能调节的多功能信号酶,通过其重要底物活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)去磷酸化和核内转位发挥功能调节作用。大量研究表明,CaN/NFAT信号通路不仅参与多种免疫系统疾病的发生发展,调控肿瘤发生过程的基因转录表达,介导心肌肥大的病理生理过程,还参与破骨细胞的分化。但国内外关于该信号通路与血管钙化之间的关系,相关研究报道较少。 本实验采用高磷培养基建立大鼠VSMCs钙化模型,测定VSMCs中NFAT mRNA、蛋白质的表达及CaN活性,VSMCs中Ca定量定性,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,并观察CaN特异性抑制剂环孢霉素A(cyclosporin A,CsA)对CaN表达及对VSMCs钙化的影响,初步探讨CaN/NFAT信号通路对大鼠VSMCs钙化的调节,为血管钙化相关临床疾病的预防及治疗提供新的治疗策略。 方法:大鼠VSMCs(A7r5)1株(购于中国科学院上海细胞库),经传代培养后,随机分为3组,A组:对照组;B组:钙化组;C组:钙化+CsA组简称CsA组。待细胞长满瓶底,测细胞密度为10/mm,A组给予正常对照的培养基,B组给予高磷(2mmol/l)培养基诱导钙化,C组给予高磷(2mmol/L)+CsA(5ug/ml)培养基,每组同等条件下培养6天,每3天换液一次,第6天收集细胞。 将收集的各组细胞Western Blot测定NFAT蛋白、实时荧光定量反转录PCR法测定NFAT mRNA、ELISA法测定VSMCs的Ca活性及CaN活性、比色法测定ALP活性、光镜下观察茜素红染色VSMCs的钙化情况。所有数据以均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS 13.0统计软件,首先对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验,组间资料比较应用单因素方差分析,P0.05),无统计学意义,与CsA抑制CaN活性有关,但较钙化组(21.47±1.86IU/L)表达也显著增加(P0.01),有统计学意义。(3)ELISA法测定大鼠VSMCs Ca定量分析结果为钙化组(9.01±0.32pg/ml)较对照组(6.03±0.33pg/ml)Ca定量显著增加(P0.01),CsA组(10.39±0.70pg/ml)较对照组(6.03±0.33pg/ml)Ca定量也显著增加(P0.01),且较钙化组(9.01±0.