玄参环烯醚萜苷类成分提取分离及其基于网络药理学的抗脑缺血靶点预测

作     者：周炳文 

作者单位：浙江中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄真

授予年度：2018年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：玄参 环烯醚萜苷 网络药理学 脑缺血 靶点预测 

摘      要：目的玄参环烯醚萜苷具有抗脑缺血活性,但目前对于其抗脑缺血活性的物质基础和作用机制不甚明确。基于以上原因设计三部分实验:(1)优化玄参环烯醚萜苷热回流法提取工艺,以期得到结构种类尽可能多的环烯醚萜苷类化合物;(2)对玄参化学成分进行系统分离,以期得到新的环烯醚萜类化合物;(3)预测玄参环烯醚萜苷抗脑缺血活性的主要作用靶点,探讨其抗脑缺血的主要作用机制。方法(1)响应面法优化玄参环烯醚萜苷类成分的热回流提取工艺通过单因素考察选定提取温度、提取时间、料液比作为响应面优化的自变量,采用Box-Behnken中心组合设计建立模型,以梓醇、桃叶珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷的总峰面积为响应值对提取工艺进行优化。(2)玄参化学成分的分离和鉴定采用大孔树脂、硅胶柱色谱、半制备高效液相色谱等分离纯化方法,对大孔树脂50%乙醇洗脱部分的化学成分进行分离纯化,并根据质谱、H-NMR、C-NMR、二维核磁共振波谱数据进行结构鉴定。(3)玄参环烯醚萜苷抗脑缺血活性的靶点预测针对TCMSP数据库中以及文献已报道的35个玄参环烯醚萜苷类化合物,通过chemdraw构建三维化学结构,上传至pharmmapper数据库,依据反向药效团匹配方法预测其活性成分靶点。借助MAS3.0生物分子功能软件靶点信息注释,采用Cytoscape软件构建化学成分-靶点-通路网络。通过脑缺血损伤机制与构建网络的比对,预测玄参环烯醚萜苷抗脑缺血机制。结果(1)响应面法优化玄参环烯醚萜苷类成分的热回流提取工艺结果显示,最优提取条件为无水甲醇为溶剂,料液比1:15,提取温度73℃,提取时间1.2h。(2)玄参化学成分的分离和鉴定本实验共分离得到7个化合物,通过波谱数据鉴定为Cinnamic Acid(1),6’-O-cinnamoylharpagide(2),8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide(3),Harpagoside(4),Harpagide(5),Geniposide(6),Acubin(7)。其中化合物3为首次从该植物中分离得到。(3)玄参环烯醚萜苷抗脑缺血活性的靶点预测蛋白预测结果显示,玄参35个环烯醚萜苷类成分共涉及164个作用靶点蛋白,其中Ras相关的C3肉毒毒素底物1(P63000)、细胞分裂调控蛋白42同系物(P60953)、信号转导和转录激活因子1-α/β(P42224)、Caspase-3(P42574)、酪氨酸蛋白激酶JAK2(O60674)、转化生长因子β-2(P61812)、酪氨酸蛋白激酶ABL1(P00519)、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(O15530)、细胞凋亡蛋白酶激活因子1(O14727)等靶点蛋白出现频次较高,都在20次以上。靶点蛋白的通路注释和分析结果显示,玄参35个环烯醚萜苷类成分作用于64条重要通路(P0.05),其中与人类疾病相关的通路共14条,与内分泌系统相关的通路共5条,与免疫系统相关的通路共7条,与细胞进程相关的通路共6条,与信号转导相关的通路共9条,与代谢相关的通路共23条。与脑缺血疾病机制比较显示,玄参抗脑缺血活性可能与其能够缓解脑缺血后引起的酸中毒、炎症、氧化应激、细胞凋亡有关。结论(1)响应面模型拟合度好,可信度高,所得提取工艺能够有效提高玄参环烯醚萜苷的提取率。(2)玄参中首次分离得到8-O-E-p-methoxycinnamoylharpagide。(3)通过网络药理学预测玄参环烯醚萜苷类成分抗脑缺血靶点进行预测,充分体现出中药多成分、多靶点、多途径的作用特点,为深入探讨其抗脑缺血机制提供科学依据。