梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-5～9的克隆分析及HaFT-4功能验证

作     者：李亚婕 

作者单位：新疆农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马林;张桦

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 0907[农学-林学] 07[理学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：梭梭 14-3-3蛋白基因 实时荧光定量 功能验证 

摘      要：14-3-3蛋白是以同源或者异源二聚体形式存在的一类保守性很高、可以多基因编码并且具有调节功能的蛋白质家族。在调节转录因子的核定位、调控基因的表达和酶活性的调控等多种细胞活动中起到重要作用。本论文以梭梭为研究对象,采用RT-PCR方法分离并成功克隆出5个14-3-3蛋白基因,进行了生物信息学的初步分析。采用q RT-PCR方法研究5个基因在干旱胁迫下表达水平。利用农杆菌介导转化法获得了HaFT-4基因转烟草植株,并对转HaFT-4基因烟草进行相关分析。主要研究结果如下:1.成功克隆5个梭梭14-3-3蛋白基因,命名为HaFT-5、Ha FT-6、HaFT-7、HaFT-8和Ha FT-9。5个14-3-3蛋白基因ORF大小分别为420 bp、681 bp、789 bp、792 bp和789 bp分别编码139、226、262、263和262个氨基酸。分别对这5个基因编码的氨基酸序列的生物信息学进行了分析,预测得出,HaFT-5为稳定蛋白,其余4个蛋白为不稳定蛋白。这5个蛋白都是亲水蛋白,均没有信号肽,同时不存在跨膜结构。蛋白质序列相似性比对发现,5个14-3-3蛋白中HaFT-5与Ha FT-6与甜菜的同源性最高,HaFT-7aFT-9与菠菜的同源性最高,均达到90%以上。分子进化树可以得出,HaFT-5与甜菜聚为一支,HaFT-6与葡萄和百合聚为一支,HaFT-7与Ha FT-9被聚为一支的同时均和菠菜聚为一支,HaFT-8与菠菜聚为一支。2.利用实时荧光定量对5个14-3-3蛋白基因在20%PEG6000模拟干旱胁迫处理0 h、4 h、8 h、12 h和24 h的表达量进行分析,HaFT-5基因在12 h产生最高表达量,后明显下降。Ha FT-6a FT-9基因均在干旱胁迫8 h有最大表达量,之后逐渐降低。HaFT-9基因的相对表达量有最显著的变化,但是Ha FT-6基因与未胁迫时相比表达量变化不显著。3.成功构建了pCAMBIA1304-HaFT-4植物表达载体,用农杆菌介导转化叶盘法将该基因转入烟草中,获得5株转基因烟草植株。选择3株转基因植株及野生型烟草植株叶片进行干旱、盐及低温胁迫后分析丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和叶绿素的变化情况。结果表明,3株转HaFT-4基因植株经过胁迫后变化趋势较为相似,但是3株转HaFT-4基因烟草植株相较于野生型烟草植株的丙二醛含量降低,脯氨酸积累增加,可溶性糖含量升高,叶绿素含量也升高。综合来看,转Ha FT-4基因烟草对于逆境具有更强的抵御能力。