天然橡胶生物合成限速酶基因Hmg1启动子的克隆与功能鉴定

作     者：张福城 

作者单位：华南热带农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈守才

授予年度：2006年

学科分类：0710[理学-生物学] 0907[农学-林学] 07[理学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：巴西橡胶树 生物合成 限速酶 Hmg1启动子 克隆 功能鉴定 

摘      要：天然橡胶是关系到国计民生的主要战略物资,是不可缺少的工业原料之一。我国天然橡胶严重短缺,大部分依靠进口。然而,由于橡胶树种植具很高的地域要求,且我国橡胶树种植面积扩大的潜力很有限,因此,提高橡胶单产是发展我国天然橡胶产业的唯一出路。与橡胶树胶乳生产相关的3个主要因素(产胶、排胶及乳管分化)中,产胶即橡胶生物合成对提高橡胶单产具有重要的影响,而3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶是橡胶生物合成途径的限速酶之一,它由3个基因组成的基因家族(Hmg1、Hmg2、Hmg3)编码。根据Chye等的报道,Hmg1在乳管中的表达高于叶片,能被乙烯诱导表达,Hmg2无组织特异性,Hmg3的启动子与大多数持家基因的启动子一样,缺少TATAbox,它在叶片和胶乳中同等程度地进行组成型表达。因此,研究Hmg1的启动子具有重要的理论意义和应用价值。 为了验证Hmg1基因在橡胶树胶乳与叶片中的表达情况,本研究首先分别提取橡胶树主栽品系热研7-20-59、7-33-97的胶乳与叶片总RNA进行northern分析,结果表明:Hmg1在乳管中大量表达,而在叶片中完全没有表达。这与Chye等报道的结果不一致。 本研究利用Genomic Walking方法从橡胶树主栽品系热研7-33-97的叶片基因组DNA中克隆到Hmg15′端882bp的调控序列,通过http://***/seqools/***在线预测的基础启动子存在于-49～+1与-236～-186区域中。通过Plant Care软件(http://***:8080/PlantCARE/)在线分析Hmg1启动子中含有的顺式作用元件。结果表明,882bp的调控序列中除了TATA-motif、CAAT-motif典型的真核生物顺式调控元件外,还含有ERE、HSE、CGTCA-motif、WUN-motif等重要的顺式调控元件及一些与光反应相关的元件。 通过PCR方法对Hmg15′端882bp的调控序列进行缺失,并分别替换表达载体pCAMBIA1301及pCAMBIA1302的35S启动子,构建了分别以GUS和绿色荧光蛋白为报告基因的6个序列缺失表达载体,分别命名为p1301H900、p1301H500、p1301H300与p1302H900、p1302H500、p1302H300。 分别用以GUS和绿色荧光蛋白为报告基因的Hmg15′端调控序列缺失表达载体进