鸭瘟病毒SDWF株的分离鉴定及致病性研究

作     者：张坤 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刁有祥

授予年度：2012年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸭瘟病毒(DPV) 分离鉴定 环介导等温扩增技术(LAMP) SPF鸭 病理组织学变化 间接免疫荧光染色(IFA) 

摘      要：鸭瘟(DuckPlague，DP)，是由鸭瘟病毒(Duckplaguevirus，DPV)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性接触性传染病，其特征是流行广泛、传播迅速、发病率和死亡率高，严重威胁养鸭业的发展。 鸭瘟于1923年由Baudet首次在荷兰报道，之后在许多国家均有流行。1957年黄引贤在我国广州报道了本病。至今，全国各养鸭地区均有本病流行的报道，为了更有效的防治DPV，有必要发展简单、快速的检测方法和良好的病原检测及定位手段，并对其致病机理进行深入研究。本研究内容包括四部分： 一、鸭瘟病毒SDWF株的分离鉴定 通过鸭胚尿囊膜接种，从疑似鸭瘟病例中分离到1株病毒，采用血清中和试验、动物回归试验和PCR方法对分离毒株进行了鉴定，并对毒株的生物学特性进行了研究。致病性试验结果表明，分离毒株人工感染SPF鸭的症状及剖检变化与自然感染病例相同;分离株无血凝活性;鸭胚半数致死量ELD50为10-4.33/0.2mL;对氯仿、乙醚敏感;不耐酸碱、不耐热。分离毒株PCR鉴定结果显示，PCR产物与预期大小一致，其产物序列与鸭瘟病毒标准强毒株相应片段核苷酸的同源性为99.9%。上述结果表明，分离毒株为DPV，且为强毒株，命名为SDWF株。 二、鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法的建立与应用 为建立一种简便、快速、灵敏、特异的DPV检测方法，本研究根据GenBank中登录的DPV基因组序列，设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物，经优化反应体系，建立了LAMP快速检测方法。结果表明，LAMP方法能够在63℃恒温下，1h内实现目的核酸的大量扩增。结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBRGreenⅠ染料，就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化。该方法敏感性可达0.245pg/μL，比普通PCR灵敏性高10倍;对Ι型鸭肝炎病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭新城疫病毒、鸭源偏肺病毒等的核酸无交叉反应;利用建立的LAMP检测方法对40份临床样品的阳性检出率为30%。该方法简便快捷，省时省力，是一种适用于基层实验室快速、准确检测DPV的方法。 三、鸭瘟病毒强毒株感染SPF鸭动态病理组织学研究 将纯化的DPV人工感染2月龄SPF鸭，定期剖杀试验组和对照组鸭，对各组织器官的病理组织学变化进行观察，并进行血常规和血液生化指标检测。结果显示：人工感染后24h，感染SPF鸭中枢免疫器官胸腺、法氏囊淋巴细胞数量减少，组织间隙增大;肝脏、脾脏组织病变较为严重，其余组织器官均出现程度较轻的病理变化。感染后48～96h，中枢免疫器官的淋巴细胞极度减少，网状细胞增生，组织器官结构模糊不清，严重充血、出血;其余组织器官出现细胞变性、出血等病理变化。感染后120h，组织细胞变性、坏死，出现大片坏死区。点眼滴鼻组SPF鸭感染DPV后组织学变化与皮下注射组相似，只是发生的时间推后约24～48h。对照组SPF鸭病理组织学观察未见损伤。WBC、HGB、AST、ALT等发生显著变化。该结果表明，接种DPV强毒感染SPF鸭的组织器官严重受损，特别是免疫器官，甚至会引起免疫抑制。 四、间接免疫荧光染色（IFA）检测鸭瘟病毒及在鸭体内的抗原定位 将纯化的DPV免疫清洁级新西兰白兔，高免血清经辛酸-硫酸铵法和葡聚糖G200柱纯化，制得第一抗体。以FITC标记的山羊抗兔IgG为第二抗体，通过反应条件的优化，建立了DPV间接免疫荧光（IFA）快速诊断方法。试验结果表明：一抗的最佳稀释度为1:100，感作时间为4℃过夜;二抗的最佳工作浓度为1:200，感作时间为37℃1h，DPV特异性黄绿色荧光最清晰。以IFA对DPV人工感染鸭的各组织器官进行检测，在死亡鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、泄殖腔、肠道、肾脏、肺脏及气管中均检测到DPV抗原，以肝脏、脾脏等组织中荧光最强。表明这些器官是DPV感染后的主要靶器官。