肝癌血清标志蛋白的分离、纯化、鉴定及抗体制备的实验研究

作     者：蒋智华 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张志勇

授予年度：2007年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：分离 纯化 鉴定 小分子蛋白质 SELDI技术 等电点沉淀法 毛细管电泳 高效液相色谱 Tricine-SDS-PAGE 质谱 生物信息学 多克隆抗体 

摘      要：目的:1、应用蛋白质组学技术中的高效液相色谱、毛细管电泳、SDS-PAGE单向电泳和质谱等技术对已从肝癌血清中筛选出9个最具有诊断价值的蛋白标志物,进行分离、纯化和鉴定,探讨蛋白分离、纯化的最佳条件,建立简便、灵敏的分离纯化小分子蛋白的方法。2、对已分离纯化出的标志蛋白进行质谱鉴定和生物信息学分析,明确其蛋白特性。3、对已分离纯化鉴定出的标志蛋白进行多克隆抗体制备,为下游标志蛋白研究做准备。 方法: 1.去除血清白蛋白:分别应用等电点沉淀法、硫酸铵沉淀法、Hitrap Blue亲和层析法、超滤法去除白蛋白,利用电泳、SELDI技术和蛋白浓度测定方法,观察白蛋白的去除情况和目的蛋白的保留情况,建立血清白蛋白去除的最佳实验条件。 ***-SDS-PAGE电泳分离和回收凝胶蛋白:应用Tricine-SDS-PAGE电泳方法对已经去除白蛋白处理后的样品,进行目标蛋白的初步分离纯化,SELDI技术对回收后的标志蛋白进行鉴定。 3.串联质谱技术进一步分离鉴定目标蛋白,以及目标蛋白的生物信息学分析: 3.1 HPLC-MS分离鉴定和生物信息学分析:对已明确的标志蛋白凝胶条带,切胶回收消化,高效液相色谱串联质谱鉴定,并对鉴定结果作生物信息学分析。 3.2 CE-MS分离鉴定:利用BSA标样建立毛细管电泳串联质谱鉴定蛋白的方法;应用所建立的方法分离鉴定含目标蛋白的样品。 4.多克隆抗体制备:已分离纯化鉴定的标志蛋白进行多克隆抗体制备。 结果: 1、应用等电点沉淀法、硫酸铵沉淀法、Hitrap Blue亲和层析法、超滤法对血清去除高丰度白蛋白,电泳、CM-10蛋白质芯片和蛋白浓度检测结果显示,PH5.6的等电点沉淀法去除白蛋白后,所得到的样品中含有的目的蛋白最多、含量最高,白蛋白去除的最彻底,电泳凝胶可清晰出现目标蛋白范围的条带,初步确定它为本研究分离纯化肝癌标志蛋白的第一步。硫酸铵沉淀法和超滤法去除白蛋白的效果不理想;Hitrap Blue层析柱能有效去除白蛋白,但在电泳凝胶图的10KD以下未出现任何染色条带。 2、肝癌(或正常人)血清经过PH5.6的等电点沉淀法处理后,进行Tricine-SDS-PAGE电泳分离后,凝胶结果显示,目标蛋白分子量范围内的出现清晰蛋白质条带(分别于6.5—9.5KD;9.5KD-14.4KD之间),且凝胶背景清晰。 3、对目的蛋白条带进行切胶、电洗脱回收,CM-10芯片检测。检测结果显示,此法有效回收目的蛋白8710Da、8596Da,且周围的杂蛋白已显著减少。 4、对分离出的含目标蛋白条带(含8710Da、8596Da)进行LC-ESI-MS,应用Mascot软件搜索蛋白质数据库,结果目标蛋白被鉴定为阿朴脂蛋白AⅡ(Apo AⅡ),Mowse分值为79(P0.05)。 5、生物信息学分析发现,蛋白质的编号(P02652)为阿朴脂蛋白AⅡ的前原蛋白,是一个未成熟的分泌蛋白,其中的一条氨基酸链含有77个(或76个)氨基酸,MW=8 707.9Da(或MW=8579.78),pI=5.05,可能与目标蛋白8710.19 Da、8579.07 Da(pI在4.0—5.6范围)的分子量相似。 6、利用毛细管电泳串联质谱(CE-MS)对酶解的标样BSA进行质谱鉴定,应用Macot软件检索对比鉴定为BSA,Mowse分值为210。而CE-MS应用于含目标蛋白的电洗脱浓缩液进行分离,未检索到可信的蛋白质,有待进一步改善。 7、将前期工作已分离纯化鉴定的目标蛋白7984M/Z制备成多克隆抗体,抗体效价检测为1:729000,免疫血清的OD曲线明显高于免疫前的OD曲线,并且与另两种蛋白抗体的交叉实验呈阴性结果。纯化抗体的电泳结果只出现50KD、25KD,与IgG的重链、轻链分子量吻合。 结论: 1、PH5.6的等电点沉淀法能在尽量保留血清中目标蛋白的同时,最高效地去除高丰度杂蛋白,可作为初步分离纯化肝癌血清标志蛋白的第一步。 2、Tricine-SDS-PAGE电泳是一种有效分离小分子蛋白的简便有效的方法,可作为进一步分离纯化肝癌血清标志蛋白的第二步。 3、第三步电泳得到的目标蛋白,可通过两种方法进一步分离和鉴定。第一种是应用HPLC-MS/MS技术,通过对标志蛋白8710Da、8596 Da成功鉴定证实,HPLC-MS/MS技术可以达到分离鉴定部分目标蛋白的目的。第二种是利用CE-MS/MS技术分离鉴定,虽然本研究中CE-MS/MS对目标蛋白分离鉴定没有得到理想结果,但该技术对酶解标样BSA的成功鉴定,提示CE-MS/MS技术仍是具有价值的分离鉴定目标蛋白的方法。